Einfluss bestimmter bone morphogenetic proteins auf die endotheliale Permeabilität

Abstract

Erhöhte endotheliale Permeabilität ist die Ursache vieler vaskulärer Erkrankungen und führt zu Gewebsödemen und Entzündungen. Ursächlich für eine endotheliale Dysfunktion kann der Verlust der transmembranen Proteine Occludin und VE-Cadherin sein. Infolge einer Abnahme der endothelialen Zell- Zellkontakte kommt es zu einer Kontraktion und Umstrukturierung des Zytoskelettes, wodurch vermehrt immunrelevante Zellen durch den erweiterten endothelialen Spalt dringen können. Bone morphogenetic proteins (BMPs) spielen bei der endothelialen Inflammation eine wichtige Rolle. Die Wirkungsmechanismen der BMPs auf die endotheliale Permeabilität sind bis heute jedoch unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es herauszufinden, ob und über welche Mechanismen, bestimmte BMPs und deren Modulatoren die endotheliale Permeabilität beeinflussen. Um Permeabilität messbar zu machen, wurden im Rahmen dieser Arbeit in vitro und in vivo Methoden etabliert. Zellkulturergebnisse wurden über einen Transwell gewonnen, in dessen oberes Kompartiment die zu testende Epithelschicht oder Endothelschicht auf einen Filter aufgetragen wurde. Als Permeabilitätsindikator fungierte ein fluoreszierender Farbstoff (FITC-Dextran) oder isolierte Immunzellen (PBMCs). Gemessen wurde die Menge des diffundierten Farbstoffes oder der transmigrierten PBMCs durch die Zellschicht, nach Stimulation der Zellen mit den BMPs oder ihren Modulatoren. In vivo wurden zur Permeabilitätsmessung Mäuse mit Bleomycin oder BMP4 behandelt. Als Permeabilitätsindikator fungierte hier der Farbstoff Evans Blue (EVB), der in die Schwanzvene injiziert wurde. Photometrisch quantifiziert wurde die Menge des Farbstoffes der in Herz, Lunge, Niere, bronchoalveoläre Lavage (BAL) und Aszitesflüssigkeit diffundieren konnte. Nach Zellschädigung, verursacht durch Stimulation mit Bleomycin, wurde analysiert, ob die epitheliale und endotheliale Permeabilität zunimmt. In vitro im Transwell führt die Schädigung der Bronchialepithelzellen zu einer erhöhten FITC-Dextran Permeabilität. In vivo zeigten die Mäuse eine signifikant höhere EVB Diffusion in Lunge, Niere und BAL. Nach Stimulation mit BMP2, 4, 7 und 9 konnte im Transwell ein signifikanter Permeabilitätsanstieg durch die Endothelzellschicht gemessen werden. In vivo zeigen Mäuse nach Stimulation mit rekombinanten murinen BMP4 i.p. eine signifikant höhere Evans Blue Diffusion in die Aszitesflüssigkeit und Herz, Lunge und Niere. Vor hohem klinischem Interesse ist die Frage, ob sich BMPs auf die Transmigration von Entzündungszellen auswirken. In vitro wurde eine Inflammation durch TNF-a induziert und in vivo durch Thioglycolate. Nach BMP4 Stimulation nimmt die Anzahl der transmigrierten PBMCs in vitro durch die Endothelzellschicht zu. In vivo konnten nach BMP4 Stimulation mehr Leukozyten im Blut und in der Aszitesflüssigkeit gezählt werden. Um festzustellen wie sich BMPs und deren Modulatoren auf die transmembranen Proteine auswirken, wurde die Expression von VE-Cadherin, Occludin und PECAM1 mit Hilfe eines Western Blots quantifiziert. Hierfür wurden Endothelzellen über drei Tage mit BMP2 4, 7 und 9 stimuliert. Anschließend wurde die Protein Expression mit Antikörpern für VE-Cadherin, Occludin und PECAM1 im Western Blot sichtbar gemacht und quantifiziert. BMP2 und 4 führen zu einer signifikanten Reduktion von Occludin, BMP2, 4 und 7 reduzieren signifikant die Expression von VE-Cadherin. Diese Reduktion konnte für BMP4 mit Hilfe einer VE-Cadherin Färbung visuell dargestellt werden. Nach knock down von BMP4 kam es zu einem Anstieg von VE- Cadherin. BMP9 reduzierte als einziges getestetes BMP die Expression von PECAM1 signifikant. Auch in einer BMP9 Konzentrationsreihe und einer speziellen PECAM1-Färbung konnte die Reduktion von PECAM1 nach Stimulation mit BMP9 bestätigt werden. Zusätzlich wurde mit Hilfe einer Phalloidinfärbung gezeigt, dass die Stimulation mit BMP2, 4, 7 und 9 die Zellmorphologie des Endothels verändert und zu einer vermehrten Ausbildung von Stressfasern führt. Um eine Substanz zu finden, die sich schützend auf die endotheliale Permeabilität auswirkt, wurde die Wirkung der BMP-Modulatoren Gremlin, Noggin, TSG, BMPER, LDN und Chordin auf die endotheliale Permeabilität getestet. Gremlin stärkt die endotheliale Barrierefunktion und führt zu einer gesteigerten Expression von Occludin. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmalig zwei Mitglieder der BMP Familie, BMP4 und Gremlin, mit gegensätzlicher Wirkung auf die endotheliale Permeabilität identifiziert werden. BMP4 führt zu einer erhöhten endothelialen Durchlässigkeit durch die Reduktion von Occludin und VE-Cadherin. Der BMP Antagonist Gremlin führt hingegen zu einer gesteigerten Barrierefunktion des Endothels durch die erhöhte Expression von Occludin. Die gezielte Hemmung der BMP Aktivität könnte zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten in der Behandlung von Ödemen und Entzündungen führen.

Endothelial injury is a central finding in vascular disease and is accompanied by disruption of the endothelial barrier function leading to tissue edema and inflammation. Endothelial barrier dysfunction is caused by loss of transmembrane proteins such as Occludin and VE-cadherin, and by loss of cell- cell contacts and cytoskeletal contraction and reorganisation leading to paracellular gaps and penetration of protein-rich fluid and inflammatory cells. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are important in endothelial inflammation, but their effects on endothelial permeability have not been investigated until now. The intention of this thesis is to determine, why and by which effects specific BMPs and their antagonists influence the endothelial permeability. In this thesis, in vitro and in vivo methods were established to detect and to measure permeability. In vitro, a transwell was applied where epithelial or endothelial cells were seeded on the upper insert. As permeability indicators, fluorescent dye (FITC-dextran) or isolated immune cells (PBMCs) were inserted. The amount of diffused FITC-dextran or transmigrated PBMCs through the cell layer was measured after the stimulation of the endothelial cells by adding the BMPs or the BMP antagonists. For analyzing the endothelial permeability in vivo, mice were stimulated with bleomycin or BMP4 and subsequently injected with Evans blue (EVB) into the tail vein as permeability indicator. By using a spectrophotometer, the amount of diffused Evans blue in heart, lung, kidney, bronchioalveolar fluid (BAL), and ascites fluid was quantified. After bleomycin induced injury of endothelial and epithelial cells, the content of diffused FITC-dextran was higher, compared to the untreated cells. In vivo, the content of EVB in lungs, kidneys, and BAL fluid was significantly higher after bleomycin stimulation. In vitro, endothelial cells were seeded on transwell chambers and were cultured in the presence of BMPs. Stimulation with BMP2, 4, 7, and 9 enhanced the endothelial permeability. In vivo, mice were stimulated with recombinant murine BMP4. After three days, EVB was injected intravenously. In lung, kidneys, heart, and ascites the EVB content after BMP4 injection was significantly higher. Inflammation was induced in vitro with TNF-a and in vivo with thioglycolate. After three days of additional BMP4 stimulation endothelial permeability was increased. In vitro, more PBMCs were able to transmigrate through the endothelial cell layer. In vivo, leukocytes in blood and leukocytes in ascites were significantly higher. Bone morphogenetic proteins regulate protein expression of tight and adherens junctions in endothelial cells. Endothelial cells were exposed to BMP2, 4, and 7 and were lysed afterwards. The lysates were used for western blotting with anti- occludin, anti-VE-cadherin and anti-PECAM1 antibody. Using western blotting BMP2 and BMP4 decreased expression of occludin. After stimulation with BMP2, 4, and 7, the expression of VE-cadherin was downregulated. Furthermore, the VE-cadherin expression in endothelial cells was shown by immunohistofluorecence and was down regulated after injection of BMP4. The VE- cadherin expression was increased after BMP4 knock down. BMP9 decreased the expression of PECAM1, depending on the BMP9 concentration, this was shown by western blotting and immunohistofluorescence. Bone morphogenetic proteins increase actin stress fiber formation and endothelial cell contraction. Therefore, endothelial cells were exposed to BMP2, 4, 7 and 9. The cells were fixed and actin cytoskeleton was stained with phalloidine. To find a protein to protect the endothelial barrier function, endothelial cells were cultured in the presence of BMP-modulators Gremlin, Noggin, TSG, BMPER, LDN and Chordin, with the result that Gremlin decreased endothelial permeability due to upregulation of occludin. In conclusion BMP4 and the BMP-antagonist Gremlin were identified as novel regulators of endothelial barrier function with opposing effects. While BMP4 increased endothelial leakage due to downregulation of occludin and VE-cadherin, antagonist of BMP activity Gremlin increased occludin expression and reduced endothelial permeability. Inhibition of BMP activity may open new therapeutic options in the treatment of edema and transmigration of inflammatory cells.