Sizing up the host and parasite genotype considerations relevant to the choice of candidate subunit vaccine antigens intended to render cattle immune to Theileria parva

Abstract

The dissemination of Theileria parva immortalized bovine lymphoblasts into lymphoid and nonlymphoid tissues results in East Coast Fever – a disease that continues to ravage cattle herds owned by resource poor small holder farmers and pastoralists throughout eastern, central, and southern Africa. The shortcomings of available control options are exemplified by failing acaricides and chemotherapeutics, and the technical and operational inadequacies of the live vaccination regime termed infection and treatment method (ITM). These constraints have provided impetus towards the development of subunit vaccines intended to render genetically diverse out-bred cattle populations immune to challenge by antigenically distinct parasites in the field throughout the endemic areas. Schizont antigens complexed with cattle class I MHC induce CD8+ cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) that are the major effectors for immune control of T. parva. However, at present, there is insufficient information to predict the constraints to recombinant vaccine development based on induction of protective CTLs that may be imposed by functional divergence within cattle class I MHC genes. The first of the two broad studies described herein, utilized amplicon-based next generation sequencing combined with rigorous read processing algorithms to obtain reliable class I MHC genotypes from a field population of African native Bos taurus (Ankole). The study then leveraged progress in 'reverse immunology' to infer the extent of functional difference among the class I MHC alleles expressed by Ankole cattle as well as by exotic (Holstein) cattle. Finally, the study sought to ascertain if the dissimilarities seen in the in silico predictions of class I MHC peptide binding specificities between the two taurine lineages could be corroborated by ex vivo tests assaying cytokine responses to defined T. parva antigens. The major findings from the first study included: (i) the identification of 18 novel cattle class I MHC allelic sequences in Ankole cattle, (ii) the evidence of positive selection for sequence diversity including in residues that predominantly interact with peptides in Ankole class I MHC, (iii) the evidence from in silico functional analysis of peptide binding specificities that are largely distinct between the two breeds and (iv) the demonstration that CD8+ T-cells derived from Ankole cattle that were seropositive for T. parva did not recognize vaccine candidate antigens originally identified in Holstein cattle breeds. This includes the immunodominant Tp1 which is currently the main focus of ongoing ECF recombinant vaccine trials. Taken together, the data clearly demonstrates that overlap between the peptide binding specificities of cattle class I MHC molecules is likely to be largely confined to alleles belonging to the same breed. These differences have the implication that a number of different antigens/epitopes will need to be incorporated in a CD8+ T-cell based recombinant antigen cocktail vaccine to provide broad coverage. In addition to the cellular responses, a contribution of humoral responses in mediating immunity against the sporozoite stage of the parasite has been documented. The closest approach to an effective anti-sporozoite vaccine to date has used a recombinant version of p67, the major sporozoite surface antigen of T. parva that is the target of antibodies that can potentially neutralize the establishment of infection. However, exposure of p67 immunized cattle to field tick challenge has resulted in very limited protection relative to experimental laboratory trials. The second study sought to shed light on the possible impacts of heterologous parasite challenge on the protection afforded to p67 immunized cattle. The concern was that whereas the gene encoding p67 is conserved in all cattle-derived populations of T. parva, it remained unclear whether parasites that originate from buffalo, and capable of causing severe disease in co-grazing cattle, contain diverse or invariant p67 genotypes. The primary analysis involved examining allelic variation, principally length polymorphisms and amino acid diversity in the closely juxtaposed B cell epitopes mapped to the central region of the p67 protein. The study also sought to shed light on the mechanisms that underpin molecular evolution of the p67 gene. The findings included: (i) the identification of ten discrete p67 allelic sequences with an overall DNA polymorphism of 19.6%. This contrasts with the complete conservation of nucleotides at the p67 locus, including introns and the third base in codons, in cattle-transmissible isolates, (ii) the demonstration that the p67 allelic sequences described herein varied widely in size principally due to the 129 and 174 base pair deletions in the central region of the gene, (iii) the identification of an in-frame deletion and nonsynonymous substitutions in the two closely juxtaposed B cell epitopes in the central region of the p67 protein respectively, (iv) the demonstration of an evolutionary pattern within the T. parva p67 locus that is consistent with the effects of positive selection. In sum, these findings suggest that a p67 based vaccine suitable for field use, particularly where a wildlife reservoir of infection is present, should incorporate polymorphic epitopes as an improvement to the current conserved p67 vaccine antigen. The totality of the data presented here provides a more informed picture of the development needs of subunit vaccines satisfying both the efficacy and coverage criteria. The key recommendation is that priority should be given to grouping cattle class I MHC alleles into functional ‘supertypes’, once extensive polymorphism data is collated so as to better inform the feasibility of generating CD8+ T-cell based vaccines with a high population coverage regardless of 'breed' differences. It could also be helpful to re-assess the field performance of the p67 vaccine based on simultaneous immunization with vaccine constructs expressing the allelic variants described herein.

Theileria parva, der Erreger des Ostküstenfiebers, verursacht im östlichen, zentralen und südlichen Afrika eine Erkrankung von großer wirtschaftlicher Bedeutung, wobei die an Ressourcen armen Kleinbauern und Pastoralisten am meisten darunter zu leiden haben. Der Erreger dringt in Lymphozyten der Rinder ein und ruft eine unkontrollierte Teilung und Immortalisierung der infizierten Wirtszellen Zellen hervor. Das Fehlen geeigneter Kontrollmaßnahmen wird durch umweltschädliche Akarizide und Chemotherapeutika sowie durch technische und operative Unzulänglichkeiten der Immunprophylaxe („infection and treatment method - ITM“) verdeutlicht. Diese Beschränkungen haben die Entwicklung von Subunit-Impfstoffen gefördert, um in endemischen Gebieten genetisch unterschiedliche Rinderpopulationen gegen eine Infektion durch antigenetisch verschiedene Feldstämme zu immunisieren. Schizonten-Antigene, die in Form von Petiden von MHC-Klasse-I-Molekülen infizierter Rinder-Zellen präsentiert werden, induzieren CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die als Haupteffektoren der Immunkontrolle gegen T. parva fungieren. Derzeit gibt es allerdings ungenügende Informationen um die Einschränkungen für die Entwicklung eines rekombinanten Impfstoffes basierend auf der Induktion von protektiven CTLs vorherzusagen, die durch die funktionelle Divergenz des Rinder-Klasse I MHC bedingt sind. Um zuverlässige Klasse I MHC Genotypen von einer Feldpopulation des in Afrika beheimateten Bos taurus Rindes (Ankole) zu erhalten, benutzte diese Studie Amplikonbasierte Sequenzierungen kombiniert mit rigoros gefilterten Sequenz-Algorithmen. Außerdem, nutzte die Studie den erzielten Fortschritt in der „ reverse Immunologie“, um das Ausmaß der funktionalen Unterschiede zwischen den Klasse I MHC Allelen, die durch die Ankole und exotische (Holstein-) Rinder exprimiert wurden, zu bestimmen. Schließlich wurde versucht festzustellen, ob die beobachteten Unterschiede in den in silico-Vorhersagen der Klasse I MHC Peptid-Bindungsspezifitäten zwischen den beiden taurinen Linien durch die Zytokinbildung durch CTLs auf eine Stimulation mit definierten T. parva-Antigenen bestätigt werden können. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie waren: (i) die Identifizierung von 18 neuen Klasse I MHC Allelsequenzen bei Ankole Rindern, (ii) der Nachweis für eine positive Selektion für Sequenzvielfalt des Ankole Klasse I MHC, einschließlich der Positionen, die vorwiegend mit Peptiden interagieren, (iii) die Beweise aus der in silico-funktionellen Analyse von Peptidbindungsspezifitäten, die sich weitgehend zwischen Ankole und Holstein Rinderrassen unterscheiden, und (iv) dass CD8+ -T-Zellen, die aus Ankole- Rindern stammten, die für T. parva seropositiv waren, keine Impfkandidaten- Antigene erkannten, die ursprünglich in Holstein Rindern identifiziert wurden. Dies schließt das immun-dominante Tp1 Antigen ein, das der Schwerpunkt der laufenden rekombinanten Impfstoff-Studien gegen Ostküstenfieber ist. Zusammengenommen zeigen die Daten eindeutig funktionelle Unterschiede zwischen den in verschiedenen Rinderrassen exprimierten Klasse I MHC Genen und deuten stark darauf hin, dass eine Anzahl von verschiedenen Antigenen / Epitopen in einen rekombinanten Antigen-Cocktail-Impfstoff auf CD8+ -T-Zellen integriert werden müssen, um eine breiten Impfschutz zu erzielen. Zusätzlich zur Rolle der CTLs wurde auch die Bedeutung der humoralen Immunantwort bei der Schutzvermittlung gegen die Sporozoite des Parasiten analysiert. Der naheliegenste Ansatz für einen wirksamen Anti-Sporozoiten-Impfstoff war bisher die Verwendung einer rekombinanten Version von p67, dem Haupt-Sporozoiten- Oberflächen-Antigen von T. parva, dass das Angriffsziel von Antikörpern ist, die möglicherweise die Entstehung einer Infektion neutralisieren können. Jedoch führte in einem Feldversuch eine Zeckenexposition bei mit p67 immunisierten Rindern nur zu einem sehr beschränkten Schutz im Vergleich zu experimentellen Labortests. Die zweite Studie untersuchte die möglichen Auswirkungen eines heterologen Parasitenchallenges auf den Schutz von mit p67 immunisierten Rindern. Während das für p67 kodierende Gen in allen in Rindern vorkommenden T. parva Populationen konserviert ist, ist nicht bekannt, ob die aus dem Büffel stammenden Parasiten, die eine schwere Erkrankung bei Rindern verursachen, verschiedene oder unveränderte p67-Genotypen enthalten. Die primäre Analyse befaßte sich zunächst mit Allele-Variationen, vor allem Längenpolymorphismen und Aminosäurevielfalt in den eng benachbarten BZell- Epitopen, die der zentralen Region des p67-Proteins zugeordnet sind. Ein weiteres Ziel der Studie war die molekularen Mechanismen der Evolution des p67-Gens aufzuklären. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erzielt: (i) die Identifizierung von zehn diskreten p67-Allelsequenzen mit einem Gesamt-DNS- Polymorphismus von 19,6%. Dies steht im Gegensatz zu der vollständigen Konservierung von Nukleotiden am p67-Locus, einschließlich Introns und der dritten Base in Codon, in von Rindern übertragbaren Isolaten, (ii) der Nachweis, dass die hier beschriebenen p67-Allelsequenzen hauptsächlich aufgrund der 129- und 174-Basepaar-Deletionen im zentralen Bereich des Gens variierten, (iii) die Identifizierung einer In-Frame-Deletion und Substitutionen, die zu Aminosäureveränderungen in den zwei eng benachbarten B-Zellepitopen im zentralen Bereich des p67-Proteins führen, (iv) die Demonstration eines Evolutionsmusters innerhalb des T. parva p67-Lokus, was im Einklang mit den Effekten der positiven Selektion steht. Zusammenfassend deuten diese Befunde darauf hin, dass ein p67-basierter Impfstoff, der für den Feldgebrauch geeignet ist, insbesondere wenn ein Wildtierreservoir der Infektion vorhanden ist, die polymorphen Epitope als eine Verbesserung des gegenwärtig konservierten p67-Impfstoffantigens enthalten sollte. Basierend auf diese Daten ist zu empfehlen die Gruppierung von Rinder-Klasse-I-MHC- Allelen in funktionelle "Supertypen" Priorität zu erhalten, sobald umfangreiche Polymorphismus-Daten zusammengetragen sind, um die Herstellung von CD8 + T-Zell-basierten Impfstoffen mit einem breiten Anwendungsbereich zu verbessern, unabhängig von den unterschiedlichen Rinderrassen, zu ermöglichen. Es könnte auch hilfreich sein, die Feldeignung des p67-Impfstoffes, basierend auf der gleichzeitigen Immunisierung mit Impfstoffkonstrukten, die die hier beschriebenen Allelvarianten exprimieren, neu zu bewerten.