Untersuchungen zur strukturellen Basis der Reaktionsspezifität von 5-Lipoxygenasen und deren biologische Bedeutung

Abstract

Lipoxygenasen (LOXn) sind Fettsäuredioxygenasen, die in der Pathogenese entzündlicher und hyperproliferativer Erkrankungen eine wichtige Rolle spielen. Sie zeichnen sich durch eine hohe Reaktionsspezifität aus, die für die biologische Wirkung der Enzyme bedeutsam ist. Die Kristallstruktur der meisten LOXn belegt, dass sie aus einer kleinen N-terminalen Domäne und einer großen C-terminalen Domäne bestehen. Trotz der umfangreichen Strukturdaten ist die mechanistische Basis der Reaktionsspezifität von LOXn und die Funktion ihrer N-terminalen Domäne noch nicht völlig geklärt. Während die Volumenhypothese der Reaktionsspezifität davon ausgeht, dass die Eindringtiefe der Arachidonsäure ins aktive Zentrum die Positionsspezifität bestimmt, postuliert die Orientierungshypothese, dass dies von der Ausrichtung des Substrats am aktiven Zentrum abhängt, wobei alternativ das Methyl- oder das Carboxylende der Fettsäure in die Substratbindetasche eintaucht. In dieser Arbeit wurden die humane und die murine 5-LOX als rekombinante Enzyme in E. coli exprimiert und ihre katalytischen Eigenschaften charakterisiert. Anschließend wurden durch ortsgerichtete Mutagenese verschiedene Enzymvarianten erzeugt, um festzustellen, welche Theorie zur Reaktionsspezifität auf diese LOXn anwendbar ist. Die hier erhaltenen Daten belegen die Anwendbarkeit der Volumenhypothese auf 5- LOXn. Durch konsekutive Mutation kritischer Aminosäuren gelang es, die murine 5-LOX schrittweise in ein 15-lipoxygenierendes Enzym umzuwandeln. Obwohl die Validität der Orientierungshypothese nicht ausgeschlossen wurde, konnten keinerlei Daten erhoben werden, welche die Anwendbarkeit dieser Hypothese wahrscheinlich machen. Weitergehende Untersuchungen ergaben die eingeschränkte Anwendbarkeit des G-vs- A-Konzepts für die Enantioselektivität der murinen 5-LOX. Frühere Trunkationsexperimente an der humanen 5-LOX deuteten darauf hin, dass die N-terminale Domäne für die katalytische Aktivität dieses Enzyms unverzichtbar sei. Hier konnte jedoch gezeigt werden, dass gentechnische Trunkation der murinen 5-LOX zu einer katalytisch aktiven Enzymspezies führt, die trotz eingeschränkter katalytischer Aktivität eine unveränderte Positionsspezifität zeigt. Diese Daten deuten auf eine regulatorische Funktion der N-terminalen Enzymdomäne im Katalysemechanismus hin.

Lipoxygenases are dioxygenases, which play an important role in the pathogenesis of inflammatory and hyperproliferative diseases.They are characterised by high reaction specificity that is significant for their biological effect. The crystal structure of most LOXs shows that they consist of a small N-terminal ß-barrel domain and a larger mostly helical catalytic domain. Despite the existence of this data, the mechanical background of the reaction specificity and the function of the N-terminal ß-barrel domain remain unclear. Two hypotheses illustrating the mechanistic differences between arachidonic acid 5- and 15-lipoxygenation exist. The space-hypothesis states that the volume of the substrate-binding pocket determines it's positional- specificity. On the other hand the orientation hypothesis states that the alignment of the arachidonic acid is a critical factor. There is also the possibility that arachidonic acid enters the substrate-binding pocket either with the methyl terminus first or with its carboxyl group. To test the applicability of these two hypotheses, mouse Alox5 was expressed in Escherichia coli and its catalytic activity was characterised. Afterwards variants of the enzyme were created by site-directed mutagenesis. The obtained data prove the applicability of the space-hypothesis on mouse Alox5. Consecutive mutations of critical aminoacids led to the formation of a 15-lipoxygenating enzyme from a 5-lipoxygenating enzyme. The validity of the orientation hypothesis couldn't be expulsed nor proved. Further experiments demonstrated the limited applicability of the G-vs-A-concept of enantioselectivity for mouse Alox5. Former truncation experiments of the human 5-LOX indicated that the N-terminal ß-barrel domain is essential for the funcion of this enzyme. Here it could be shown that truncation of murine Alox5 leads to an enzyme with reduced catalytic activity, but unaltered positional- specificity. This data indicates a regulatory function of the N-terminal domain.