Untersuchungen zur Sekundärstruktur des humanen Glucosetransporters GLUT1 durch Cystein-Scanning-Mutagenese in Verbindung mit der funktionellen Testung unter Einsatz von Sulfhydrylreagenzien

Abstract

Zwei Regionen des GLUT1 wurden durch Cystein-Scanning-Mutagenese mit anschließender funktioneller Testung unter Einsatz der Sulfhydrylreagenzien p-Chloromercuribenzolsulphonat (pCMBS) und N-Ethylmaleimid (NEM)analysiert. Dabei dienten als Expressions- und Transportsystem des GLUT1 Oozyten des Frosches Xenopus laevis. Nach einem aus der Literatur entnommenen Sekundärstrukturmodells des GLUT1 (12erTM-Modells), umfasste die erste untersuchte Domäne das gesamte Transmembransegment 2 und Teile der ersten extrazellulären Schleife, der zweite Bereich das gesamte Transmembransegment 7 und Teile der vierten extrazellulären Schleife. Weiterführende Untersuchungen durch Injektion von pCMBS in Xenopus Oozyten und Protektionsversuche ausgewählter Cysteinmutanten erbrachten keine konkreten Hinweise, dass eine der für pCMBS oder NEM sensitiven Mutanten an einer intrazellulär bzw. extrazellulär lokalisierten Substratbindungsstelle des GLUT1 beteiligt ist. Die wichtigsten Ergebnisse und Schlussfolgerungen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1\. Der Austausch der nativen Aminosäuren durch Cystein führte in der überwiegenden Anzahl zu Cysteinmutanten, die funktionell aktiv waren. Sieben der 55 mutierten GLUT1 Transporter (F72C, G75C, G76C, G79C, S80C, G286C und N288C) wiesen Transportaktivitäten auf, die in Relation zum cysteinfreien GLUT1 weniger als 10 % der katalytischen Aktivität betrugen.

2\. Die Ergebnisse, die durch den Einfluss der Sulfhydrylreagenzien pCMBS und NEM auf die Transportaktivität der Cysteinmutanten gewonnen wurden, bestätigen die auf Basis von Hydropathieplots postulierten Membranübergänge des 12erTM- Modells des GLUT1 in Position 66/67 (Übergang zwischen extrazellulärer Schleife 1 und Transmembransegment 2) sowie in Position 292/293 (Übergang zwischen Transmembransegment 7 und extrazellulärer Schleife 4).

3\. Darüber hinaus machte die Analyse der funktionellen Daten ?-helikale Strukturen für beide Transmembransegmente wahrscheinlich. Einige der gewonnenen Daten waren mit neueren Modellen zur Membrantopologie des GLUT1 nicht vereinbar.

4\. Erstmalig konnte gezeigt werden, dass der GLUT1 in den untersuchten Regionen Spalten in Membranregionen bildet, die für externe in Wasser gelöste hydrophile Substanzen zugänglich sind. Der vorgestellte methodische Ansatz war jedoch nicht geeignet, einen strukturierten Membranspalt von der zytoplasmatischen Seite her zu identifizieren.

5\. Durch auffällige Veränderungen der Basalaktivität verschiedener Cysteinmutanten im Transmembransegment 2 wurde ein Glycingerüst identifiziert, dass Raum schaffen kann für mögliche lokale Interaktionen zwischen Polypeptidstrukturen und Lipiden in der Plasmamembran.

6\. Ein neuer Aspekt in der Diskussion um eine mögliche Oligomerisierung des GLUT1 ergab sich aus der Analyse des Transmembransegments 7, das Strukturen aufweist, die einem Glutaminfinger entsprechen und, wie für andere Proteine gezeigt, theoretisch eine Oligomerisierung unterstützen.

7\. Während alle bisher publizierten Konformationsmodelle eine Beteiligung des Transmembransegments 7 an der Porenbildung des GLUT1 vorsehen, wird durch diese Arbeit erstmalig nun auch auf experimenteller Basis eine Beteiligung des Transmembransegments 2 wahrscheinlich. Dies führte in neuester Zeit zu einer Modifizierung der Vorstellung über das Helixarrangement des Glucosetransporters GLUT1.

Two regions of the secondary structure of GLUT1 were investigated using cysteine-scanning mutagenesis in conjunction with the sulfhydryl reagents para-chloromercuribenzenesulfonate (pCMBS) or N-ethylmaleimide (NEM). Xenopus laevis oocytes were used for heterologous expression and functional analysis of GLUT1. According to the widely accepted secondary structure these domains cover the C-terminal end of the first extracellular loop and the full length transmembrane segment 2, and, in addition, the entire transmembrane segment 7 and seven adjacent amino acid residues at the N-terminal end of the fourth extracellular loop. Injection of pCMBS into the cytoplasm of Xenopus oocytes or protection experiments were performed with negative results thus excluding the possibility that the investigated cysteine positions are at or near the exofacial or endofacial glucose binding site. The major results and conclusions are as follows:

1\. Cysteine-scanning mutagenesis generated single cysteine mutants that in most cases were functionally active glucose transporters. In contrast, seven of the 55 cysteine mutants (F72C, G75C, G76C, G79C, S80C, G286C und N288C) exhibited transport activities of less than 10% compared with cys-less GLUT1.

2\. The prediction with respect the putative boundaries between transmembrane segment and extracellular space at position 66/67 (transition between extracellular loop 1 and transmembrane segment 2) or 292/293 (transition between transmembrane segment 7 and extracellular loop 4) was in line with the functional data obtained by use of pCMBS and NEM, respectively.

3\. Moreover, the functional data supported an ?-helical structure for both investigated domains. They disagreed in part with recently proposed alternative topology models.

4\. The presented data demonstrated for the first time that transmembrane 2 and 7 were able to form crevices that are accessible to external hydrophilic substances but failed to show such clefts from the cytoplasmic side of the plasma membrane.

5\. Functional tests identified a cluster of three functionally essential glycine residues within transmembrane segment 2. They were localized opposite to the pCMBS-accessible cysteine residues within the helix. This group of glycine residues may form a grove to give space to a lipid side chain and/or may facilitate interaction between helix 2 and other transmembrane helices or lipid side chains.

6\. Transmembrane 7 revealed a structure named glutamine finger. This structure is known from other proteins to favour oligomerization thus adding a novel argument with regard to possible mechanisms of a putative GLUT1 oligomerization.

7\. All conformational models, so far published, consider transmembrane 7 of GLUT1 a part of a putative pore for glucose transfer. The presented experimental results indicated that also transmembrane 2 could be involved in the pore formation. These data led to modification regarding the helix arrangement of the 12 transmembrane segments of GLUT1.