A transgenic probiotic bacterium as a carrier for a nematode immunomodulatory protein for the treatment of intestinal inflammation

Abstract

Inflammatory Bowel Disease (IBD) is an auto-inflammatory disorder characterized by unregulated intestinal inflammation. Current therapies are unable to treat all patients afflicted with the condition and are often accompanied by undesirable side effects. Therefore, an urgent demand exists for the development of novel therapies. Parasitic nematodes actively secrete products modulating the host’s immune system which enables them to persist and reproduce for long periods of time. Parasite driven immunomodulation has been shown to ameliorate murine experimental gut inflammation and clinical IBD in humans. Cystatin secreted by the filarial nematode Acanthocheilonema viteae (AvCys) has strong anti-inflammatory properties when in contact with immune cells, predominantly targeting macrophages. A novel treatment for IBD was developed utilizing a probiotic bacterium, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), genetically modified as a carrier for AvCys to allow for the site-directed, prolonged secretion of the immunomodulator in the gut. The transgenic probiotic EcN-AvCys was applied in a murine model of acute colitis, where it significantly suppressed the intestinal expression of chemoattractants, infiltration of inflammatory cells and T-cell cytokine responses, leading to drastically lowered inflammatory scores. To assess the anti-inflammatory activity of EcN-AvCys in a genetically diverse, outbred model equipped with a gastrointestinal tract highly similar to that of humans, high doses were repeatedly applied to piglets suffering from post-weaning intestinal malfunction. The treatment significantly reduced post-weaning gut inflammation and, importantly, was safe in terms of body weight development and immune function. Furthermore, EcN-AvCys treatment significantly improved colon epithelial barrier functions. Similarly, short-term exposure of porcine colon tissue and human intestinal epithelial cells to EcN-AvCys supernatants improved transepithelial resistance. To analyse the mechanistic basis for the anti-inflammatory action of EcN-AvCys, the phenotype of porcine monocytes was investigated after incubation with EcN or EcN-AvCys cell culture media supernatants, or recombinant AvCys. While recombinant AvCys had very little effect on the expression of monocyte markers related to phenotypic specialization and function, EcN and EcN-AvCys supernatants induced the indiscriminate early expression of M1 associated markers, as well as regulatory IL-10. To test the hypothesis that AvCys may interfere with pro- inflammatory macrophage functions by interfering with the inflammasome and thus activation of the pro-inflammatory cytokine IL-1ß, monocytes and macrophages where exposed to supernatants of the transgenic and control probiotic and IL-1ß secretion was determined. However, EcN-AvCys supernatant supported rather than suppressed the secretion of IL-1ß in response to inflammasome induction in monocytes. Thus additional research is required to determine the mechanistic basis for the documented anti-inflammatory activity of EcN-AvCys in murine and porcine gut inflammation models and further evaluate its applicability as a treatment for human IBD.

Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind Autoimmunerkrankungen, die durch eine ungeregelte Darmentzündung gekennzeichnet werden. Heutige Therapien sind nicht bei allen betroffenen Patienten wirksam und oft mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden. Daher besteht ein dringender Bedarf für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden. Parasitische Nematoden sekretieren immunmodulatorische Moleküle, die es ihnen gestatten, längerfristig im Wirt zu überleben und sich dort fortzupflanzen. Studien mit an CED erkrankten Menschen und experimentell herbeigeführten Darmentzündungen bei Mäusen zeigten, dass die Immunmodulation der Nematoden die Symptome von CED sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen abmilderte. Cystatin, welches von der Filarie Acanthocheilonema viteae sekretiert wird (AvCys), wirkt stark entzündungshemmend bei Kontakt mit Immunzellen, vor allem bei Makrophagen. Eine neuartige Behandlung von CED wurde unter Verwendung des probiotischen Bakteriums Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) entwickelt. Hierbei werden transgene Bakterien, welche das AvCys Gen exprimieren, in den Wirtsdarm eingebracht um eine anhaltende Applikation des entzündungshemmenden Cystatins direkt vor Ort zu ermöglichen. Der Einsatz der transgenen EcN-AvCys Probiotika bei Mäusen mit akuter Kolitis bewirkte eine deutliche Reduktion der Expression von Chemoattraktanzien, der Einwanderung von Entzündungszellen und der T-Zellantwort im Darm. Dies führte zu einer insgesamt drastisch reduzierten Entzündungsreaktion. Da der Magen-Darmtrakt von Schweinen sehr dem des Menschen ähnelt, wurde die entzündungshemmende Aktivtät von EcN-AvCys daraufhin an einer genetisch diversen Versuchstierpopulation von Hausschweinen getestet. Dabei wurden Ferkeln, die nach der Entwöhnungsphase an einer Darmfehlfunktionen litten, wiederholt hohe Dosen von EcN-AvCys verabreicht. Die Behandlung reduzierte erheblich die Darmentzündungen und stellte überdies kein Risiko für die Körpergewichtsentwicklung und Immunfunktion der Ferkel dar. Um die mechanistische Grundlage für die antiinflammatorische Wirkung von EcN-AvCys zu analysieren, wurde der Phänotyp der Monocyten der Schweine unter verschiedenen Bedingungen untersucht: (1) nach Inkubation mit Überständen aus Zellkulturen von EcN, (2) EcN-AvCys bzw. (3) rekombinantem AvCys. Während rekombinates AvCys sehr wenig Einfluss auf die Expression von Monozyten- Markergenen hatte, induzierten die Überstände von sowohl EcN als auch EcN- AvCys Kulturen gleichsam eine frühe Expression von M1-assoziierten Markern sowie regulatorischem IL-10. Anschließend wurde die Hypothese getestet, dass AvCys die entzündungsfördernden Makrophagen-Funktionen stören könnte indem durch Beeinträchtigung des Inflammasoms die Aktivierung des entzündungsfördernden Zytokins IL-1ß gehemmt wird. Hierzu wurden Monozyten und Makrophagen mit Überständen der transgenen und Kontrollkulturen der probiotischen Bakterien inkubiert, wobei die Sekretion von IL-1ß überwacht wurde. Anstatt die Sekretion von IL-1ß als Reaktion auf die Induktion des Inflammasoms zu unterdrücken, förderte EcN-AvCys jedoch sogar die Sekretion des Zytokins. Es bleiben also zusätzliche Untersuchungen erforderlich, um die mechanistische Grundlage für die dokumentierte antiinflammatorische Aktivität von EcN-AvCys im Maus- und Schweinedarmmodell zu ergründen. Diese Kenntnisse wären von Bedeutung um die Eignung von EcN-AvCys als Behandlungsmöglichkeit für die CED des Menschen besser einschätzen zu können.