Einfluss des lysophospholipidbasierten Immunmodulators FTY720 auf die Cyclosporin A induzierte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in glatten Gefäßmuskelzellen

Abstract

Es ist allgemein anerkannt, dass das Immunsuppressivum Cyclosporin A eine gefäßtoxische Wirkung besitzt und beispielsweise durch oxidativen Stress eine ausgeprägte endotheliale Dysfunktion verursachen kann. Gerade diese Eigenschaft ist es, die für viele chronische Transplantatabstoßungen verantwortlich gemacht wird. Weiterhin konnte mehrfach deutlich gezeigt werden, dass Lysophospholipide wie Sphingosin-1-Phosphat (S1P) gefäßprotektive Funktionen besitzen, welche durch rezeptorvermittelte Vorgänge gesteuert werden. Daher stellt sich die Frage, ob bei nierentransplantierten Patienten durch eine Therapie mit lysophospholipid-basierten Immunmodulatoren eine Verbesserung der Transplantatfunktion erreicht werden kann. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Einflüsse des lysophospholipid-basierten Immunmodulators FTY720 auf die Cyclosporin A induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu untersuchen. Aus diesem Grund sind in vitro verschiedene Experimente mit glatten Gefäßmuskelzellen thorakaler Aorten von Wistar-Kyoto-Ratten durchgeführt worden. Zur Messung des Einflusses verschiedener Substanzen auf die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies ist ein fluoreszenztechnisches Verfahren verwendet worden, wobei mit Hilfe des Farbstoffes H2DCFDA und eines Fluorescence-Microplate-Readers die jeweilige Menge an ROS quantitativ erfasst worden ist. So konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass Cyclosporin A eine zeit- und dosisabhängige Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in den verwendeten glatten Gefäßmuskelzellen auslöst. Diese Eigenschaft zeigte sich in hohen Konzentrationen ebenfalls bei dem Lysophospholipid S1P, was sehr wahrscheinlich auf einen dosisabhängigen zelltoxischen Effekt zurückzuführen ist. Bei FTY720 trat dieser Effekt nicht auf. Die Kombination der Lysophospholipide mit Cyclosporin A führte bei FTY720 zu einer dosisabhängigen Reduzierung der Cyclosporin A induzierten Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies um bis zu 30%. Bei dem Sphingosin-1-Phosphat konnte dieser Effekt in mittleren Konzentrationen ebenfalls beobachtet werden. Um die Abhängigkeit der beschriebenen Ergebnisse von den bekannten Subtypen des S1P- Rezeptors näher zu untersuchen, sind zusätzlich spezifische Rezeptorantagonisten verwendet worden. Größten Einfluss auf die durch FTY720 und S1P verursachte Hemmung der Cyclosporin A induzierte Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies hat der spezifische S1P3-Rezeptorantagonist JTE-013 gezeigt. Durch Blockade dieses Rezeptors konnte der hemmende Einfluss von S1P und FTY720 auf die ROS-Produktion fast vollständig wieder aufgehoben werden. Weitere Experimente haben gezeigt, dass die S1P1- und die S1P2-Rezeptoren nur eine untergeordnete Rolle bei der Hemmung spielen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in der vorliegenden Arbeit in vitro der hemmende Einfluss von Sphingosin-1-Phosphat und des lysophopholipid-basierten Immunmodulators FTY720 auf die von Cyclosporin A induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies in glatten Gefäßmuskelzellen von Rattenaorten nachgewiesen werden konnte. Dieser Effekt wird offensichtlich über den S1P3-Rezeptor vermittelt. Welche Rolle diesen Erkenntnissen bei der Entwicklung neuer, nicht gefäßschädigender Medikamente für die Posttransplantationsphase zukommt, bleibt weiteren Arbeiten vorbehalten.

The vasotoxicity of the immunosuppressive drug cyclosporin A (CyA) is well known. As one of the underlying mechanisms CyA has been found to cause a massive endothelial dysfunction through the induction of oxidative stress. This reaction in particular is thought to be responsible for many chronic rejections of transplanted organs. In this context lysophospholipids such as sphingosine-1-phosphate (S1P) have been reported to exert protective effects, which are mediated via receptor-dependent mechanisms. These observations raise the question, whether treatment of renal transplant patients with lysophospholipid-based immunomodulators may have a positive effect on the function of the transplant. Thus, it is the intention of the present work to analyse the influence of the lysophospholipid-based immunomodulator FTY720 on CyA induced production of reactive oxygen species (ROS). In order to investigate this matter, a variety of in vitro experiments with vascular smooth muscle cells derived from thoracic aortas of Wistar-Kyoto rats have been performed. The quantitative impact of miscellaneous substances on ROS generation was assessed via special fluorescence technique, applying the fluorochrome H2DCFDA and a fluorescence micro-plate reader. In the present study CyA induced a time and dose-depended production of ROS in vascular smooth muscle cells. Similar results were obtained investigating high-doses of the lysophospholipid S1P, which may be explained due to cytotoxic side-effects of the drug. In contrast, FTY720 did not influence ROS production. The combination of lysophospholipids and CyA resulted in a dose-dependent reduction of CyA induced ROS generation of up to 30%. In co-incubations applying S1P, similar effect in medium concentrations were observed. In another set of experiments specific receptor antagonists were used in order to determine which of the different S1P-receptor subtypes were responsible for the effects observed. The S1P3-receptor antagonist JTE-013 was found to almost fully reverse the beneficial effects of FTY720 and S1P in the context of CyA induced production of ROS. In contrast, antagonists of S1P1- and S1P2-receptors did not significantly influence the FTY720 and S1P dependent inhibition of CyA induced ROS. In summary, this work demonstrates an inhibitory effect of S1P and the lysophospholipid-based immunomodulator FTY720 on the cyclosporin A induced production of ROS in vascular smooth muscle cells. The effects seem to be mediated via the S1P3-subtype of S1P receptor. The impact of the present results concerning the development of new, vasoprotecitve drugs for the post-transplantation period yet remain to be investigated by further studies.