Die Multilocus Sequenz Typisierung als neue Methode zur molekularen Charakterisierung von Ornithobacterium rhinotracheale

Abstract

Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) ist ein bedeutender respiratorischer Krankheitserreger beim Geflügel, insbesondere bei Puten. Verschiedene Typisierungsmethoden wurden für Isolate des Bakteriums genutzt, um diese voneinander differenzieren zu können. In der Routinediagnostik hat sich insbesondere die Serotypisierung etabliert. Bisher sind 18 ORT-Serotypen nachgewiesen worden; es können aber nicht alle Stämme mit den Referenzseren typisiert werden und es gibt zahlreiche Kreuzreaktionen zwischen verschiedenen Serotypen. Neben der Serotypisierung wurden auch bandenbasierte Typisierungsmethoden, wie die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE), angewandt. Isolate von Puten und Hühnern sind in diesen Untersuchungen sehr homogen, während ORT-Isolate von anderen Vogelspezies deutlich diverser in den genetischen Fingerprints erscheinen. Nachteile der bandenbasierten Typisierungsmethoden liegen in der Standardisierung und dem schwierigen Austausch der Ergebnisse zwischen verschiedenen Laboren, weshalb Isolate nur begrenzt miteinander verglichen werden können. Demgegenüber stehen sequenzbasierte Methoden, bei denen die Weitergabe der Ergebnisse (z.B. über das Internet) schnell und einfach möglich ist. In der hier beschriebenen Arbeit wurde die Multilocus Sequenz Typisierung (MLST) für ORT anhand von 90 Feldisolaten und 18 Referenzstämmen etabliert. Die Methode hat eine gute Diskriminationsfähigkeit, ist in der Durchführung hoch standardisierbar und wird für Bakterien häufig angewendet. Es wurden sieben Haushaltsgene für die MLST ausgewählt, teilsequenziert und Sequenzunterschiede miteinander verglichen. Bei Puten- und Hühnerisolaten zeigten sich in der MLST große Ähnlichkeiten unabhängig von der geographischen Herkunft, die auf eine klonale Populationsstruktur hinweisen. Fast 80% (67/84) der untersuchten ORT-Isolate von Puten und Hühnern gehören zu den zwei Sequenztypen ST1 und ST9, die sich nur in einem Allel voneinander unterscheiden. Achtzehn (58,1%) der insgesamt 31 definierten ST werden durch Isolate anderer Vogelarten repräsentiert, obwohl deren Anteil an der Gesamtzahl der untersuchten Stämme nur bei 22,2% (n=24) lag. ORT-Isolate von Greifvögeln und Isolate von Tauben grenzten sich phylogenetisch deutlich voneinander ab, zeigten aber eine nahe Verwandtschaft auf der Ebene der Vogelfamilie. Die Greifvogelisolate gruppierten sich innerhalb der beiden Hauptcluster der Geflügelisolate ein, während die Taubenstämme ein eigenes Cluster entfernt von anderen Vogelisolaten bildeten. Die erstellte MLST Datenbank (https://pubmlst.org/orhinotracheale/) bietet eine gute Grundlage, um aktuelle Sequenzdaten zu ergänzen und mit den bisher gewonnenen zu vergleichen. Eingetragene Hintergrundinformationen zu den Isolaten können zukünftig wichtige Einblicke in die Epidemiologie des Erregers, das Wirtspektrum und mögliche regionale Unterschiede bei Krankheitsausbrüchen geben.

Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) is an important respiratory poultry pathogen that mainly affects turkeys. Different typing methods have been used for the characterization of ORT isolates. In routine diagnostics, serotyping is well established. Eighteen ORT serotypes have been detected so far. However, not all isolates can be typed with available reference antisera and cross-reactions often occur between different serotypes. Despite serotyping, banding pattern-based methods such as pulsed-field gel electrophoresis have been applied. ORT isolates of turkey or chicken origin appear very homogenous in those investigations, while ORT isolated from other bird species are more diverse in their genetic fingerprints. Disadvantages of banding pattern-based methods are difficulties in standardization and in the exchange of results between different laboratories limiting comparisons to other isolates and data sets. In contrast, the exchange of results from sequencing-based methods (e.g. via internet) is fast and simple. In this work, a new multilocus sequence typing (MLST) scheme was established using 90 field isolates and 18 ORT serotype reference strains. The method has a good discriminatory ability, is highly standardizable and is frequently used for different bacterial species. Seven housekeeping genes were selected for MLST, were partly sequenced, and the obtained sequences were compared to each other. Isolates from turkeys and chickens showed high similarities within the MLST analysis independent of their geographical origin indicating a clonal population structure. Almost 80% (67/84) of the investigated ORT isolates of turkey and chicken origin belonged to two sequence types, ST1 and ST9, which differ only in one single allele. Eighteen (58,1%) of the 31 defined ST are represented by isolates from other bird species although their percentage among the 108 strains investigated was only 22,2% (n=24). ORT isolates from birds of prey and isolates from pigeons were placed into different phylogenetic clusters but showed a close relationship corresponding to the birds’ family relationship of their hosts. Isolates from birds of prey grouped within the two poultry-based clusters, whereas the pigeon-derived isolates formed their own phylogenetic cluster well separated from ORT strains of other birds’ origin. The newly set up MLST database (https://pubmlst.org/orhinotracheale/) provides a reliable basis to add further sequence data and compare new results to already registered MLST data. Included background information from ORT strains will give important insights into the epidemiology of the pathogen, its host range and regional differences in disease outbreaks.