Involvement of Toll-like Receptor 2 in Recognition of Orientia tsutsugamushi by the Innate Immune System

Abstract

Scrub typhus, an infectious disease caused by O. tsutsugamushi, is widely distributed in Asia and the Pacific region including Northern Australia, with more than one billion people at risk of contracting the disease and probably more than one million new cases every year. O. tsutsugamushi, which was classified as a separate genus in the Rickettsiaceae family, is an obligate intracellular bacterium that is transmitted via the skin by mite bites. Little is known about the early immunological events of O. tsutsugamushi infection. Particularly, the role of immediate innate immune responses induced by pattern recognition receptors such as toll-like receptors (TLRs) and NOD-like receptors in response to O. tsutsugamushi remains poorly understood. The goal of this study was to identify an innate receptor responsible for recognition of bacterial surface structures of O. tsutsugamushi and to investigate its role in a mouse infection model. First, an in vitro overexpression system for innate receptors was used in order to test reactivity with O. tsutsugamushi. HEK293 cells transiently transfected with human TLR2, TLR4, NOD1 or NOD2, were stimulated or infected with O. tsutsugamushi and the production of IL-8 was measured in cell culture supernatants. It was thus shown that TLR2, but not TLR4, NOD1 or NOD2, has a role in recognition of both inactivated and live O. tsutsugamushi. The TLR2 ligand of O. tsutsugamushi was heat-stable and showed complete sensitivity to treatment with hydrogen peroxide and sodium hydroxide, and partial sensitivity to proteinase K, suggesting the presence of two different TLR2 ligands in O. tsutsugamushi, possibly a lipopeptide and a protein. The requirement of TLR2 for the induction of pro-inflammatory responses was investigated in the murine macrophage cell lines 232 (C57BL/6 wild-type) and 261 (TLR-deficient). It was found that O. tsutsugamushi activated the NF-B signal transduction pathway depending on the presence of TLR2. TLR2 deficiency increased the intracellular replication of O. tsutsugamushi in macrophage cell lines in vitro. This increase in replication in TLR2-deficient macrophages was correlated with significantly lowered levels of TNF- production, indicating that decreased TNF- production by TLR2-deficient macrophages could be in part responsible for enhanced growth of O. tsutsugamushi. In consistence with these results, treatment with recombinant TNF- reduced the growth of infectious O. tsutsugamushi in a concentration-dependent manner to a similar extent in both 232 and 261 macrophage cell lines. Finally, the influence of TLR2-dependent signaling on the kinetics of O. tsutsugamushi dissemination was investigated in vivo. Infection was initiated by subcutaneous inoculation, thus mimicking the natural transmission of O. tsutsugamushi via the skin. TLR2-deficient mice and C57BL/6 wild types showed no significant differences in the recruitment of inflammatory monocytes and neutrophils to the regional lymph node during the first week of infection. On a cellular level, at day 5 post infection, a significantly lower bacterial load was found in TLR2-deficient inflammatory monocytes compared to wild type cells, while neutrophils had very low bacterial loads in both mouse strains. Although TLR2-deficient macrophages supported more efficient bacterial growth in vitro, it is possible that the higher bacterial load in wild type monocytes in vivo reflects enhanced TLR2-mediated bacterial uptake rather than replication. The suppressive effect of TLR2 on bacterial replication may thus be masked in vivo by enhanced uptake. The O. tsutsugamushi loads in the lymph node and other target organs during the 3-week course of infection did not differ between TLR2-deficient and wild type mice. All animals survived the infection. Thus, TLR2-mediated pathogen recognition influenced neither the recruitment of monocytes and neutrophils nor the bacterial dissemination in vivo or overall survival following s.c. infection. Possibly, TLR2-mediated danger signaling is redundant in vivo during O. tsutsugamushi infection and can be compensated by other innate signaling pathways. Upon intraperitoneal inoculation of O. tsutsugamushi, which is more severe and potentially lethal infection, surprisingly TLR2 deficiency did not predispose for overwhelming infection, but even ameliorated the severity of symptoms and protected mice from lethal outcomes. This unexpected finding suggests the development of a TLR2-mediated immunopathology in severe, highly replicative infections with O. tsutsugamushi. This study shows for the first time that TLR2 serves as an innate receptor for O. tsutsugamushi. Instead of contributing significantly to antibacterial immunity in vivo, as it is known from infections with other pathogens, TLR2-dependent signals rather deteriorate the course of infection.

Das Tsutsugamushifieber, eine durch Orientia (O.) tsutsugamushi hervorgerufene Infektionserkrankung, ist endemisch in weiten Teilen Asiens und des pazifischen Raums sowie in Nordaustralien. Für mehr als eine Milliarde Menschen besteht das Risiko, sich zu infizieren; die Inzidenz liegt vermutlich bei mehr als einer Million Fälle jährlich. O. tsutsugamushi, eine eigene Art innerhalb der Familie der Rickettsiazeen, ist ein obligat intrazelluläres Bakterium, das beim Biss bestimmter Milbenarten durch die Haut übertragen wird. Zu den frühen immunologischen Ereignissen der Infektion mit O. tsutsugamushi ist wenig bekannt. Insbesondere fehlen Erkenntnisse über die durch das angeborene Immunsystem hervorgerufenen Immunantworten, die nach Erkennung mikrobieller Strukturen durch konservierte Rezeptoren der Toll-like- Rezeptor (TLR)- und NOD-like- Rezeptor-Familien ausgelöst werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung eines Rezeptors des angeborenen Immunsystems, der für die Erkennung bakterieller Oberflächenstrukturen von O. tsutsugamushi verantwortlich ist, und die Charakterisierung seiner Rolle für den Infektionsverlauf im Mausmodell. Zunächst wurde in vitro in einem Expressionssystem für TLR- und NLR-Rezeptoren die Reaktivität mit O. tsutsugamushi untersucht. Es wurden dazu HEK293-Zellen verwendet, die transient mit humanem TLR2, TLR4, NOD1 oder NOD2 transfiziert waren. Nach Stimulation oder Infektion mit O. tsutsugamushi wurde die Konzentration von Interleukin (IL)-8 im Überstand mittels ELISA gemessen. Es wurde so gezeigt, dass TLR2, aber nicht TLR4, NOD1 oder NOD2, an der Erkennung sowohl inaktivierter wie lebender Bakterien beteiligt ist. Der TLR2-Ligand von O. tsutsugamushi war hitzestabil und zeigte sich komplett sensibel auf Behandlung mit Wasserstoffperoxid und Natriumhydroxid, sowie teilweise sensibel auf Behandlung mit Proteinase K, was für das Vorkommen zwei unterschiedlicher TLR2-Liganden, einem Lipopeptid und einem Protein, spricht. In den Mausmakrophagen-Linien 232 (C57BL/6 Wildtyp) und 261 (TLR2-Defizienz) wurde untersucht, ob TLR2-abhängige Signale notwendig sind für die Induktion proinflammatorischer Immunantworten. Es zeigte sich, dass O. tsutsugamushi in Abhängigkeit von TLR2-Ligation den NF-B-Signalweg aktiviert. TLR2-Defizienz führte zudem zu einer stärkeren intrazellulären Vermehrung von O. tsutsugamushi in vitro. Diese stärkere Vermehrung was assoziiert mit signifikant erniedrigter Produktion von TNF-, so dass die geringere Produktion dieses Zytokins durch TLR2-defiziente Makrophagen teilweise für das stärkere Wachstum verantwortlich sein könnte. In beiden Zell-Linien ließ sich das Wachstum durch Behandlung mit rekombinantem TNF- konzentrationsabhängig auf vergleichbare Werte reduzieren. Schließlich wurde in vivo der Einfluss TLR2-abhängiger Signale auf die Disseminierungskinetik von O. tsutsugamushi untersucht. Die Infektion erfolgte durch subkutane Inokulation, was der natürlichen Übertragung von O. tsutsugamushi über die Haut sehr nahekommt. Die Rekrutierung inflammatorischer Monozyten und neutrophiler Granulozyten in die regionalen Lymphknoten während der ersten Woche der Infektion zeigte keine Unterschiede zwischen C57BL/6-Wildtypen und TLR2-defizienten Mäusen. Auf zellulärer Ebene wurde an Tag 5 nach Infektion eine signifikant niedrigere Bakterienlast in TLR2-defizienten inflammatorischen Monozyten im Vergleich zu Wildtyp-Zellen gefunden, während die Bakterienlast Neutrophiler in beiden Mausstämmen sehr gering war. Obwohl O. tsutsugamushi in vitro besser in TLR2-defizienten Makrophagen replizierte, ist es möglich, dass die höhere Bakterienlast in Wildtyp-Monozyten eher bedingt ist durch eine TLR2- abhängig verstärkte Aufnahme von Bakterien als durch ihre Replikation. Der supprimierende Effekt von TLR2 auf die Replikation könnte daher in vivo durch eine erhöhte Aufnahme von Bakterien maskiert werden. Die Gesamtlasten im Lymphknoten und anderen Zielorganen unterschieden sich nicht signifikant während des 3-wöchigen Verlaufs der Infektion. Alle Tiere überlebten die Infektion. Die TLR2-vermittelte Erkennung von O. tsutsugamushi hatte also weder Einfluss auf Rekrutierung von Monozyten oder Neutrophilen noch auf die systemische Verbreitung der Bakterien in vivo oder das Überleben nach subkutaner Infektion. Möglicherweise sind TLR2-abhängige Signalwege nicht unverzichtbar für die bakterielle Erkennung in vivo und können durch andere Signalwege der angeborenen Immunantwort kompensiert werden.