Hetero- and homodimerisation of endothelin A and endothelin B receptors

Abstract

Endothelin-1 (ET-1) is a potent vasoactive peptide that acts on endothelin A

(ETA) and endothelin B (ETB) receptors. Although both receptor subtypes are

co-expressed in numerous cells, little is known about their ability to form

heterodimers. In this study it was shown that both receptors were coimmunoprecipitated

with an ETB-specific antibody using extracts from HEK293

cells stably co-expressing a fusion protein consisting of a myc-tagged ETA

receptor and CFP (ETAmyc.CFP) and a fusion protein consisting of an ETB

receptor and YFP (ETB.YFP). Co-immunoprecipitation was also observed with

extracts from HEK293 cells transiently co-expressing FLAG-tagged ETB and

myc-tagged ETA receptors, thereby excluding that heterodimerisation is

mediated by the CFP/YFP moieties. Heterodimerisation was further confirmed

in fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis of HEK293 cells

transiently co-expressing ETAmyc.CFP and ETB.YFP receptors. Additionally

homodimerisation of ETA and ETB receptors could be demonstrated in FRET

analysis of HEK293 cells transiently co-expressing ETAmyc.CFP and

ETAmyc.YFP or ETB.CFP and ETB.YFP receptors. FRET efficiencies were

between 12 and 18% in untreated and antagonist- or ET-1-treated cells,

indicating constitutive homo- and heterodimerisation. Prolonged stimulation

(30 min) with the ETB receptor-selective agonist BQ3020 decreased FRET

efficiency by 50%. This decrease was not observed when internalisation was

inhibited by co-expression of dominant-negative K44A.dynamin I or incubation

with 450 mM sucrose. Enzyme-linked immunosorbent assay and laser scanning

microscopy of cell clones stably co-expressing ETAmyc.CFP/ETBflag.YFP

receptors revealed a slower sequestration of the ETB.flag.YFP receptors upon

stimulation with ET-1 than with BQ3020. No difference in ET-1 or BQ3020-

mediated sequestration was observed with cell clones expressing ETBflag.YFP

alone. The data suggest that ETA and ETB receptors form constitutive

heterodimers, which show a slower sequestration upon stimulation with ET-1

than with BQ3020. Heterodimer dissociation along the endocytic pathway only

occurs upon ETB receptor- selective stimulation.

Endothelin-1 (ET-1) ist ein potentes vasoaktives Peptid dessen Wirkung über

den Endothelin-A- (ETA) und den Endothelin-B-Rezeptor (ETB) vermittelt wird.

Obwohl beide Rezeptoren in zahlreichen Zelltypen koexpremiert werden, ist

nur wenig darüber bekannt ob diese Heterodimere bilden können. Mittels eines

ETB-Rezeptor-spezifischen Antikörpers wurde in dieser Arbeit eine

Kopräzipitation beider Rezeptorsubtypen aus HEK293 Zellextrakten

nachgewiesen, welche den ETA\- als myc- und CFP-Fusionsprotein und den ETBRezeptor

als YFP-Fusionsprotein stabil koexpremieren. Eine Kopräzipitation

konnte ebenfalls aus Extrakten von HEK293 Zellen nachgewiesen werden, die

transient den ETA-Rezeptor als myc- und den ETB-Rezeptor als FLAG-Epitop

markierte Rezeptoren exprimieren. Hierbei wurde ausgeschlossen, dass die

Heterodimerisierung über eine Aggregation der CFP- und YFP-Fusionsproteine

vermittet wurde. Die Heterodimerisierung wurde weiterhin durch Fluoreszens-

Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Analysen bestätigt, die an HEK293 Zellen

durchgeführt wurden, welche transient ETAmyc.CFP- und ETB.YFP-Rezeptoren

koexpremieren. Zusätzlich konnte eine Homodimerisierung der ETA-und ETBRezeptoren

in HEK293 Zellen nachgewiesen werden, welche transient

ETAmyc.CFP- und ETAmyc.YFP- oder ETB.CFP- und ETB.YFP-Rezeptoren

koexpremieren. Es wurden FRET Effizienzen zwischen 12% und 18% in

unbehandelten, Agonist- oder ET-1-behandelten Zellen gemessen, was eine

konstitutive Homo- und Heterodimerisierung nahelegt. Eine verlängerte

Stimulation (30 Min.) der Zellen mit einem ETB-spezifischen Agonisten

(BQ3020) führte zu einer Verminderung der FRET Effizienz um 50%. Diese

Reduzierung konnte nicht gemessen werden, wenn die Internalisierung durch

eine Koexpression von dominant-negativem K44A-Dynamin I oder durch die

Zugabe von 450 mM Saccharose inhibiert wurde. ELISA (enzyme-linked

immunosorbent assay) und LSM (laser scanning microscopy) Analysen wiesen

in Zellklonen, welche stabil ETAmyc.CFP- und ETBflag.YFP-Rezeptoren

koexpremieren, eine verlangsamte ET-1-vermittelte Internalisierung des

ETBflag.YFP- Rezeptors nach. Jedoch konnten keine Unterschiede in der ET-1-

oder BQ3020-vermittelten Internalisierung an Zellklonen beobachtet werden,

die den ETB.flag.YFP-Rezeptor alleine expremieren. Die vorliegenden Daten

zeigen, dass ETA\- und ETB-Rezeptoren konstitutive Heterodimere bilden, deren

Sequestrierung nach ET-1 Stimulation im Vergleich zu einer Stimulierung mit

BQ3020 verlangsamt ist. Die Dissoziation des Heterodimers während der

Internalisierung und des intrazellulären Transports erfolgt nur nach ETBRezeptor-

selektiver Stimulation.