Untersuchungen zum Nachweis pathogener Bakterien in Lebensmitteln mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Abstract

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine Nachweismethode für Mikroorganismen und stellt eine vielversprechende Alternative zum konventionellen, langsamen Kulturnachweis beziehungsweise zu anderen schnellen molekularen Detektionsmethoden ohne Möglichkeit einer Lebend/Tot- Differenzierung dar. In dieser Arbeit sollte das Potenzial von FISH für den Nachweis lebender pathogener Bakterien in Lebensmitteln evaluiert werden. Für eine Reihe wichtiger Zoonoseerreger wie S. enterica, thermophile Campylobacter spp., pathogene Yersinien oder L. monocytogenes wurden FISH-Sonden, die auf die 16S oder 23S rRNA gerichtet sind, entworfen und getestet. Die neu entwickelten Sonden waren bereits bekannten FISH-Sonden hinsichtlich ihrer Spezifität und Sensitivität häufig deutlich überlegen. Umfangreiche thermodynamische Anpassungen und der gezielte Einsatz von Kompetitoren und Nukleotidanaloga erlaubten den spezifischen Simultannachweis vieler unterschiedlicher Erregergruppen in Gegenwart nahverwandter Bakterien. Die Kombination von FISH mit dem direct viable count (DVC-FISH) erwies sich als zuverlässige Methode zur Lebend/Tot-Unterscheidung. Mit Hilfe eines FISH-Tests auf mRNA-Ebene, der durch den Einsatz eines Sondengemisches auch Zielsequenzen mit geringer Abundanz erfassen kann, konnte zusätzlich die Transkription von Antibiotikaresistenzgenen auf Einzelzellebene detektiert werden. Die Kugelmühle FastPrep-24 und mit Einschränkungen der Stomacher erwiesen sich als geeignete Homogenisierungssysteme zur Probenvorbereitung, um lebende Bakterien aus einer festen Lebensmittelmatrix herauszulösen. Nach einer ein- bis zweitägigen kulturellen Voranreicherung erreichten die entwickelten FISH-Tests eine vergleichbare Sensitivität wie die deutlich zeitaufwändigeren Goldstandardmethoden. Eine kulturunabhängige Anreicherung gelang durch mehrstufige Vorfiltrationen und nichtfluoreszierende Membranfilter. Die Zugabe eines Markerbakteriums ermöglichte gleichzeitig die Quantifizierung der Bakterienlast. FISH repräsentiert eine Brückentechnologie, die die Geschwindigkeit anderer Schnellnachweise mit der Eigenschaft der kulturellen Methoden zur Unterscheidung von lebenden und toten Bakterien verbindet. Um FISH als eine anerkannte Technik in der Lebensmittelmikrobiologie zu etablieren, müssen jedoch die Automatisierung und Standardisierung dieser Nachweismethode weiter vorangetrieben werden.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a detection method for microorganisms and represents a promising alternative to the slow conventional culture techniques or to other rapid molecular methods without the capacity to distinguish dead from viable bacteria. In this work, the potential of FISH for the detection of viable pathogenic bacteria in food was evaluated. FISH probes targeting the 16S or 23S rRNA were designed and tested for various important zoonotic agents like S. enterica, thermophilic Campylobacter spp., pathogenic Yersinia spp. and L. monocytogenes. In comparison to previously published probes, specificities and sensitivities of the newly developed FISH probes often proved to be superior. Due to thorough thermodynamic adaptations and the accurate use of competitors and nucleotide analogues, the specific simultaneous detection of multiple different pathogens in the presence of closely related bacteria was possible. The combination of FISH with the direct viable count (DVC-FISH) was demonstrated to be a suitable method to differentiate dead from viable bacteria. Furthermore, a FISH assay targeting mRNAs with a low abundance via a probe mixture enabled the detection of the transcription of antibiotic resistance genes. The ball mill FastPrep-24 and the Stomacher, with some limitations, proved to be appropriate homogenization tools for sample preparation to separate and obtain viable bacteria from a solid food matrix. After one or two days of cultural enrichment, the newly developed FISH-assays reached similar sensitivities as the much more time- consuming gold standard methods. Multistage prefiltration procedures and non- fluorescent membrane filters allowed the culture-independent enrichment. The addition of marker bacteria enabled the concurrent quantification of the bacterial load. FISH is a bridge technology, which combines the test speed of other rapid methods with the ability of the culture methods to differentiate between viable and dead bacteria. However, automation and standardization of this technique have to be promoted to establish FISH as a recognized standard method in food microbiology.