Das lebensverlängernde Gen INDY kodiert für einen Austauscher für Zwischenprodukte des Krebs-Zyklus

Abstract

In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Funktionsweise des von INDY vermittelten Membrantransports genauer untersucht. Zu diesem Zweck wurden Oozyten von Xenopus laevis als Versuchsobjekt verwendet. In die präparierten Oozyten wurde mittels Mikroinjektion cRNA des Gens INDY übertragen, um das INDY Protein in den Oozyten zu exprimieren. Anschließend wurden [14C]-Citrat oder [14C]-Succinat in die Oozyten injiziert, um sowohl den durch INDY- vermittelte [14C]-Citrat-Efflux als auch der [14C]-Succinat-Efflux im Austausch mit definierten Zwischenmetaboliten des Krebs- Zyklus zu messen, die der Badlösung zugegeben wurden. In den Versuchsreihen erwies sich INDY als DIDS-sensitiver Transporter, der kationenunabhängig war. Während der Succinat- Efflux sich in den hier gezeigten Versuchen als pH-unabhängig zeigte, war der Citrat-Efflux pH-abhängig, mit einer Steigerung des Effluxes von pHWert 6,0 über pH 7,5. INDY transportiert, wie die Ergebnisse nahe legen, Zwischenmetabolite unterschiedlicher Kettenlänge über die Zellmembran, also sowohl Dicarboxylate als auch Tricarboxylate. Aus den hier vorliegenden Ergebnissen kann gefolgert werden, dass INDY als Austauscher von dicarboxylischen und tricarboxylischen Zwischenprodukten des Krebs-Zyklus fungiert. Obwohl der endgültige Beweis aussteht, kann vermutet werden, dass INDY energiearme Metabolite mit einer höheren Kapazität als energiereichere bindet und mit einer höheren Geschwindigkeit über die Zellmembran transportiert. Es kann auch gefolgert werden, dass die Wirkung abnehmender INDY Aktivität, wie sie in den langlebigen INDY-Mutanten stattfindet, möglicherweise den Energiestoffwechsel vergleichbar der Kalorienrestriktion, ändert, welche eine Verlängerung der Lebensspanne begünstigt. Die lebensverlängernde und zugleich krankheitsvorbeugende Wirkung entsteht durch die Beteiligung der Alterungsgene wie INDY, die in einem Zusammenhang mit den Alterungsprozessen stehen. Da die Zwischenmetabolite des Krebs-Zyklus Vorstufen der Lipidgenese sind, steht der hier gezeigte Transportmechanismus in Zusammenhang mit der möglichen Entstehung von Adipositas und Diabetes Typ II. Eine Beeinflussung bzw. Herunterregulation der Aktivität von INDY könnte insbesondere der Entstehung dieser Stoffwechselerkrankungen entgegenwirken. INDY hat Ähnlichkeiten mit kürzlich entdeckten Natrium-Dicarboxylat- Kotransportern (z.B. SLC13A5), die in der Niere vorkommen (1-3). Dicarboxylat- Kotransporter sind Membranproteine, die im Krebs-Zyklus, einem der wichtigsten Stoffwechselwege eukaryotischer Zellen, bei Säugetieren für Aufnahme und Wiederaufnahme von Di- und Tricarbonsäuren verantwortlich sind (2).

In the presented work, the function of the INDY-mediated transport across the plasma membrane was examined more closely. For this purpose, oocytes of Xenopus laevis were used as test objects. In the prepared oocytes cRNA of the gene INDY were transferred by microinjection to express the INDY protein in these oocytes. Then [14C]-citrate or [14C]-succinate were injected into these oocytes to test both the INDYmediated [14C]-citrate-efflux and the [14C ]-succinate-efflux in exchange with defined Krebs-cycle intermediates, which were added to the external medium. In the experiments, INDY proved itself as a DIDS-sensitive cation-independent transporter. While succinat-efflux was shown to be pH-independent, citrate-efflux was pH-dependent with an increased efflux from pH 6,0 to pH 7,5. INDY mediates metabolites of different chain lengths across the plasma membrane, both Dicarboxylates and Tricarboxylates. From the findings, it can be concluded that INDY functions as an exchanger of dicarboxylic and tricarboxylic Krebs-cycle intermediates. Even though definitive proof is pending, it can already be deduced that INDY binds low energy metabolites with a higher capacity as high-energy metabolites and transports them faster across the plasma membrane. It can also be concluded that the effect of decreasing INDY activity, which takes place in long-lived INDY-mutants, possibly changes energy metabolism in relation to caloric restriction which promotes an extension of lifespan. The simultaneous life extending and disease preventing activity results from the participation of senescence genes as INDY, in conjunction with the ageing processes. Because Krebs-cycle intermediates are pre-stages of the lipid genesis, the transport mechanism shown here is connected to the development of Adipositas and type II diabetes. An influence with respect to downregulation of the activity of INDY could specifically counteract the development of these metabolic diseases. INDY has similarities to recently discovered sodium-dicarboxylate co- transporters (e.g. SLC13A5) existing in the kidney (1-3). Dicarboxylate co- transporters are membrane proteins which are responsible for uptake and reuptake of di- and tricarbolic acids in the Krebs-cycle, one of the most important metabolic pathways of eukaryotic cells in mammals (2).