Der Einsatz des Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE) für eine neuartige und selektive Suizidgentherapie Claudin-3 und -4 überexprimierender Tumoren

Abstract

Krebs ist eine Erkrankung, welche in den Industrieländern an Bedeutung zunimmt. Das bestimmt die Suche nach neuen Behandlungsoptionen, zu denen die Gentherapie gehört. Ein wichtiges Konzept der Gentherapie stellt die Suizidgentherapie dar. Diese beruht auf dem Einbringen therapeutischer Gene in die Tumorzellen, deren Produkte z. B. den Zelltod auslösen. Im Rahmen der Suizidgentherapie werden aufgrund der effizienten Toxizität auch bakterielle Toxine eingesetzt. Diese zeigten in einer Vielzahl von in vitro und Untersuchungen hohe antitumorale Aktivität. Das Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE) ist ein Vertreter dieser bakteriellen Toxine. Es entfaltet seine hochspezifische Wirkung über die Membranrezeptoren Claudin-3 und Claudin-4, welche in epithelialen Tumoren wie Kolon-, Mamma-, Pankreas-, Prostata-, Ovarialkarzinom überexprimiert sind. Für die selektive Behandlung dieser Tumorentitäten stellt das CPE einen attraktiven Kandidaten dar. In der vorliegenden Arbeit wurde das CPE erstmalig als therapeutisches Gen zur Eliminierung von Claudin-positiven Tumorzellen in vitro und im Rahmen einer Gentherapie eingesetzt und es wurden Untersuchungen zum zellulären Wirkmechanismus des exprimierten CPE durchgeführt. Für diese Untersuchungen wurden verschiedene humane Tumorzelllinien bezüglich der Claudin-3 und -4 Expression und der Sensitivität gegenüber rekombinantem CPE geprüft. Darüber hinaus wurden die optimalen Transfektionsbedingungen dieser Zelllinien etabliert. Als geeignete in vitro Modelle wurden die Claudin-3 und Claudin-4 positiven Zelllinien HCT116, MCF-7 und Panc-1 sowie die Claudin-negative Melanom-Linie SKMel-5 ausgewählt und in nachfolgenden in vitro Experimenten verwendet. Für die CPE-basierte Suizidgentherapie wurde das CPE-Gen (wtCPE) sowie drei weitere CPE-Varianten erfolgreich generiert: das CPE-Gen mit Signalsequenz (wtCPESS), das “Codon Usage“ optimierte CPE-Gen (optCPE) sowie das “Codon Usage“ optimierte CPE-Gen mit Signalsequenz. Die Genvarianten wurden in den Expressionsvektor pCpG-mcs G2 einkloniert. Die CPE-Expression wurde nach Transfektion der ausgewählten Zelllinien auf mRNA- und Proteinebene evaluiert. Diese Expressionsanalysen ergaben, dass das optimierte CPE Gen in allen Tumorzelllinien mit größter Effizienz exprimiert wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass das exprimierte optCPE in der Lage ist, in den Claudin-3 und -4-positiven MCF-7, HCT116 und teilweise in den Claudin-4 positiven Panc-1 Zellen hohe Zytotoxizität auszulösen. Als das am besten exprimierte Konstrukt erwies sich somit das optCPE, welches auch die stärkste zytotoxische Aktivität vermittelte. Der Einbau der Signalsequenz in die CPE-cDNA-Sequenz führte zu keiner bzw. einer sehr schwachen Expression der CPE-Konstrukte und dementsprechend zu keiner signifikanten Zytotoxizität. Es wurde gezeigt, dass die Wirksamkeit des Enterotoxins mit dem Expressionslevel des optCPE korreliert und dass die Höhe der Claudin-3 und vor allem Claudin-4 Expression die Stärke der CPE-Wirksamkeit in vitro bestimmt. Dies gilt als Beleg für die selektive Zytotoxizität der CPE-Gentherapie. Die Untersuchungen mit dem optCPE zeigten, dass die CPE-vermittelte Toxizität durch einen “Bystander-Effekt“ in vitro und auch unterstützt wird. Es konnte weiterhin festgestellt werden, dass das exprimierte CPE den nekrotischen Zelltod in den betroffenen Tumorzellen bewirkt. konnte erfolgreich mittels nicht-viralen Gentransfers die intratumorale Expression des optCPE erreicht werden. Die tierexperimentellen Untersuchungen zeigten aber vor allem die zytotoxische Aktivität des CPE- Gentransfers, die zur signifikanten Reduktion des Tumorwachstums führte und mit Nekrose der Tumoren assoziiert war. Die in vitro Ergebnisse der antitumoralen CPE-Wirkungen ließen sich somit am Tiermodell bestätigen. In dieser Arbeit konnte zusammenfassend gezeigt werden, dass die CPE- Suizidgentherapie ein großes Potenzial als neue Strategie zur effektiven und selektiven Therapie von Claudin-3 und Claudin-4 positiven epithelialen Tumoren besitzt. Von großem Wert kann dabei der Einsatz dieser Gentherapie für die lokale Kontrolle von therapieresistenten Tumoren sein, die anderen Therapien schwer oder nicht mehr zugänglich sind.

Bacterial toxins are known to be effective for cancer therapy. Clostridium perfringens enterotoxin (CPE) is produced by the bacterial Clostridium type A strain. The transmembrane proteins claudin-3 and -4, often overexpressed in numerous human epithelial tumors (for example, colon, breast, pancreas, prostate and ovarian), are the targeted receptors for CPE. CPE binding to them triggers formation of membrane pore complexes leading to rapid cell death. In this study, we aimed at selective tumor cell killing by CPE gene transfer. We generated expression vectors bearing the bacterial wild-type CPE cDNA (wtCPE) or translation-optimized CPE (optCPE) cDNA for in vitro and in vivo gene therapy of claudin-3- and -4-overexpressing tumors. The CPE expression analysis at messenger RNA and protein level revealed more efficient expression of optCPE compared with wtCPE. Expression of optCPE showed rapid cytotoxic activity, hightened by CPE release as bystander effect. Cytotoxicity of up to 100% was observed 72 h after gene transfer and is restricted to claudin-3-and -4-expressing tumor lines. MCF-7 and HCT116 cells with high claudin-4 expression showed dramatic sensitivity toward CPE toxicity. The claudin- negative melanoma line SKMel-5, however, was insensitive toward CPE gene transfer. The non-viral intratumoral in vivo gene transfer of optCPE led to reduced tumor growth in MCF-7 and HCT116 tumor-bearing mice compared with the vector-transfected control groups. This novel approach demonstrates that CPE gene transfer can be employed for a targeted suicide gene therapy of claudin-3- and -4-overexpressing tumors, leading to the rapid and efficient tumor cell killing in vitro and in vivo.