Synthetic niche to modulate regenerative potential of MSCs and enhance skeletal muscle regeneration

Abstract

Funktionelle Defizite der Skelettmuskulatur werden durch eine insuffiziente Regeneration verursacht und sind weiterhin von besonderer Bedeutung im Bereich der Orthopädie und Unfallchirurgie. Sollte das intrinsische Regenerationspotential nicht ausreichen, kommt es zur akontraktilen Vernarbung der Muskulatur. Um das Regenerationspotential zu steigern stellte sich in den letzten Jahren die künstliche Gewebewiederherstellung am vielversprechendsten dar. In Vorarbeiten konnten bereits mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Skelttmuskeltraumamodell der Ratte evaluiert werden und zeigten eine Steigerung der Muskelkraft. Obwohl die Überlebensrate der MSCs im post- traumatischen Areal durch das pro-inflammatorischen Milieu deutlich eingeschränkt ist, kommt es zu einer parakrinen Stimulation des nativen Skelettmuskelgewebes. Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass das endogene Potential von MSCs durch die Transplantation in einem geschützten Biomaterial gesteigert werden kann. Die Effektivität der transplantierten MSCs in einem Biomaterial könnte zusätzlich durch Wachstumsfaktoren stimuliert werden. Die autolog gewonnen MSCs wurden für in-vitro und in-vivo Versuche kultiviert. Um den parakrinen Effekt zu analysieren, wurden Experimente mit konditioniertem Medium hinsichtlich der Apoptose, Migration und Differenzierung durchgeführt. Im nächsten Schritt wurde das Biomaterial (Hydrogel, Alginat) mit MSCs besiedelt und die Vitalität beziehungsweise das Migrationsverhalten überprüft. Das Proteinsekretionsprofil wurde analysiert um die optimale MSC Stimulation mittels Wachstumsfaktoren zu bestimmen. In vivo wurde das Hydrogel in unterschiedlichen Kombinationen mit Wachstumsfaktoren und MSCs in einem Skelettmuskeltraumamodell der Ratte getestet. Hierfür wurde vor der Transplantation der Musculus Soleus unilateral traumatisiert. Die Muskelkraft und histologische Färbungen, im Speziellen zur Bestimmung der Muskelfaserdichte, regenerierender Muskelfaser, Fibrosierung und der Gefäßdichte wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert. Die Ergebnisse wurden intra-individuell zur Gegenseite normalisiert und die Versuchsgruppen miteinander verglichen. Die in-vitro Ergebnisse zeigen eine erfolgreiche Isolation der autologen MSCs. Das Hydrogel konnte mit MSCs besiedelt werden und ein signifikanter Einfluss auf das native Gewebe mittels erhöhter Überlebensrate, Reduktion der Apoptose und vermehrter Migration zum traumatisiertem Areal dargelegt werden. Dieser parakrine Effekt konnte durch eine zusätzliche Stimulation der MSCs mit Wachstumsfaktoren gesteigert werden. Die in-vivo Ergebnisse zeigten eine signifikante Steigerung der Muskelkraft in der MSC-Wachstumsfaktor Gruppe. Die histologischen Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse durch eine Reduktion der Fibrosierung, erhöhte Anzahl der regenerierenden Muskelfasern und eine verbesserte Durchblutung. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass das endogene Regenerationspotential von MSCs durch eine Stimulierung mittels Wachstumsfaktoren gesteigert werden kann. Eine Transplantation der MSCs in einem Hydrogel mit zusätzlichen Wachstumsfaktoren führt zu einer gesteigerten Muskelkraft durch eine vermehrte Regeneration der Muskelfasern und einer Reduktion der Narbenbildung.

In the field of orthopedic surgery, functional deficits of skeletal muscles is due to insufficient regeneration a remaining challenge. If the muscle trauma outbalances the intrinsic regenerative potential, it leads to scar formation. In the past decades, tissue engineering has been identified as the most promising approach to enhance the regenerative potential. In previous publications, mesenchymal stem cells (MSCs) were evaluated in a clinically relevant trauma model and lead to a significant improvement of muscle force. Although the survival rate of transplanted MSCs at the post-traumatic site is due to the pro-inflammatory surrounding rather low, the paracrine signaling stimulates the native tissue. The hypothesis of this work was to protect the MSCs by transplanting the cells encapsulated in a hydrogel. The endogenous potential of MSCs could be further enhanced due to growth factor stimulation. Autologous harvested MSCs were seeded in cellular culture and prepared for further in-vitro and in-vivo analysis. To evaluate the paracrine effect, conditioned-media experiments regarding apoptosis, migration and differentiation assays were performed. In the following step, cells were seeded on the biomaterial (hydrogel, alginate) and viability as well as outward migration analyzed. The protein secretion profile was studied in order to identify the most potent stimulus through growth factors. In vivo, the hydrogel, in various combinations of growth factors and MSCs, was evaluated in a skeletal muscle trauma model of the rat. Therefore the soleus muscle was unilaterally traumatized. Muscle force measurements and histological analysis, regarding muscle fiber count, regenerating fibers, fibrotic area and vasculature were performed. The results of all groups at different follow-up time points were compared after intra-individual normalization to the contralateral side. In-vitro results showed a successful isolation of autologous MSCs. The cells were encapsulated in the hydrogel and showed a significant influence on the native tissue response regarding increased survival rate, reduction of apoptosis and increased migration. The paracrine effect of encapsulated MSCs could be further enhanced due to growth factor stimulation. In-vivo results demonstrated a significant increase of muscle force in the MSC-growth factor group. Histological analysis confirmed these results by a reduction of fibrosis, increased number of regenerating fibers and increased vascular supply. In summary, the endogenous regenerative potential of MSCs can be successfully stimulated by growth factors. Transplantation of MSCs encapsulated in a hydrogel with growth factors lead to a significant increase in muscle force due to an increased in regenerating fibers and reduction of fibrosis.