Thermophilic Campylobacter in turkeys in Germany: Epidemiology, genotyping and antimicrobial sensitivity studies

Abstract

Poultry remains an important vehicle for pathogens, leading to human food borne disease all over the world. Campylobacter infection in commercial broilers and turkeys represents a challenge for all persons involved in poultry food production chain. Studying the colonization and genetic diversity along with the antimicrobial resistance of Campylobacter jejuni in commercial poultry rearing is a matter of concern. The findings of this thesis clearly indicate that age and -possible- sex have an influence on the onset of colonization and prevalence of thermophilic Campylobacter in fattening turkey farms. Drinking water can be considered as primary source for flock infection. Additionally, multiplex PCR used for detection of thermophilic Campylobacter DNA which was directly extracted from faecal and environmental samples was developed and evaluated (Chapter 2). The assessment of the genetic diversity of a Campylobacter population is critical for the understanding of the epidemiology of this bacterium and consequently this information has to be used to reduce disease burden. Hence, a part of this study was conducted to investigate the dynamic of flock colonization and genetic diversity in Campylobacter isolates using different genotyping tools. The performance of established flaA genotyping, multilocus sequencing typing (MLST) and DNA microarray typing assay based on the ArrayTube™ technology was evaluated using C. jejuni isolates that proved to be genetically stable in their flaA genes. It was shown that different typing methods are useful to determine the genetic heterogeneity of C. jejuni isolated from turkey during the rearing process. The degree of relatedness was varying depending upon the typing method used. DNA microarray technique based on whole genome information had the highest discriminatory power compared to the other molecular typing methods assessed here. The ATTM microarray system is also relatively cheap, when hands-on-time, necessary equipment, and costs of material are considered. This investigation demonstrated changing of C. jejuni in turkeys and the coexistence of different genotypes during turkey rearing for the first time (Chapter 3). A recent concern is the emergence of antibiotic resistance in C. jejuni isolated from turkeys in particular of those antibiotics used to treat human illness. Monitoring the progress of this resistance becomes a growing public health issue. The third part of this study was conducted to provide information about the resistance of C. jejuni isolated from turkeys by investigating the genes for ciprofloxacin, tetracycline and erythromycin resistance. All isolates were fully susceptible to chloramphenicol and gentamicin. The isolates were highly resistant to sulphonamides, metronidazole, ciprofloxacin, naladixic acid, and tetracycline. The isolates were sensitive to streptomycin, erythromycin, neomycin, and amoxicillin. Multidrug resistance was detected. Replacement of the Thr-86→Ile of the gyrA gene, and a tet(O) gene were the main resistance mechanisms for fluoroquinolones and tetracycline resistance, respectively, while no point mutation in the 23S rRNA gene was found that could be responsible for macrolide resistance. The present study provides sufficient data suggesting that the PCR-RFLP and MAMA-PCR are simple and rapid methods for the detection of ciprofloxacin resistance in C. jejuni. These methods seem to be suitable to serve as possible alternative methods for routine detection of mutations without the need for sequencing. To our knowledge, this is the first study providing sufficient data on the current status of the antimicrobial susceptibility to C. jejuni isolated from turkey farms in different regions in Germany (Chapter 4). During the trail to isolate Campylobacter from caecal content of female turkey at 16th week of age Two Gram negative, micro-aerophilic, non-motile and non-spore-forming coccoid bacteria were isolated. The biochemical reaction profiles (API 20 E and API 20 NE) typed both strains as Ochrobactrum anthropi. On the basis of 16S rRNA gene and recA gene sequence similarities the strains were identified as Ochrobactrum anthropi and Ochrobactrum pecoris, respectively. Both strains were highly resistant against beta-lactam antibiotics, chloramphenicol and sulphonamides but variable in susceptibility to ciprofloxacin, gentamicin and tetracycline. This is the first time that Ochrobactrum species were isolated from an avian host (Chapter 5).

Geflügel bleibt ein wichtiges Vehikel für Krankheitserreger, die zu menschlichen Lebensmittel übertragen Krankheit auf der ganzen Welt. Campylobacter-Infektion bei kommerziellen Masthähnchen und Puten stellt eine Herausforderung für alle Personen in Geflügel Nahrungsmittelproduktionskette beteiligt. Studien zur Kolonisierung, genetischen Vielfalt sowie der Resistenzentwicklung von Campylobacter jejuni in Nutzgeflügel sind deshalb von großer Wichtigkeit. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich den Einfluss von Alter und – möglich - Geschlecht von Puten auf den Beginn der Kolonisation und die Prävalenz von thermophilen Campylobacter. Tränkenwasser kann als primäre Quelle für Herde Infektion in Betracht gezogen werden. Zusätzlich Multiplex-PCR zum Nachweis von thermophiler Campylobacter DNA, die direkt von Fäkal-und Umweltproben wurde extrahiert verwendet wurde entwickelt und evulated (Kapitel 2). Die Beurteilung der genetischen Vielfalt von Campylobacter-Isolaten ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Epidemiologie dieses Bakteriums. Die so gewonnenen Daten helfen auch, die Durchseuchung der Bestände und die Inzidenz zu verringern. Daher wurde eine Studie durchgeführt, um die Dynamik der Besiedlung eines Bestandes zu untersuchen und die genetische Vielfalt der isolierten Campylobacter mit verschiedenen Genotypisierungsmethoden zu ermitteln. Die Qualität der etablierten flaA-Genotypisierung, Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST) und DNA-Mikroarray-Testung mittels der ArrayTube™-Technologie wurde mit flaA-Gen stabilen C. jejuni-Isolaten durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass alle Typisierungsmethoden eine größere genetische Heterogenität der Puten-Isolate während der Aufzucht wiedergaben, die ermittelten Verwandtschaftsverhältnisse der Isolate aber abhängig von der Untersuchungsmethode waren. Die DNA- Mikroarray-Analyse, welche das gesamte Genom in die Untersuchung einbezieht, hatte die höchste Trennschärfe im Vergleich zu den anderen molekularen Typisierungsmethoden. Das ATTM Mikroarray-System ist preiswert, wenn Zeitaufwand, notwendige Ausrüstung und die Materialkosten berücksichtigt werden. Die Untersuchung ergab eine dynamische Änderung der C. jejuni- Population in den Puten, wobei auch ein gleichzeitiges Nebeneinander verschiedener Genotypen während der Aufzucht feststellbar war (Kapitel 3). Besorgniserregend ist in den letzten Jahren die Entstehung von Antibiotika- Resistenzen bei C. jejuni-Puten isolaten, insbesondere für solche Antibiotika, die verwendet werden, um humane Erkrankungen zu behandeln. Die Überwachung der Resistenzausbildung wird ein wachsendes Problem des öffentlichen Gesundheitswesens. Daher wurde der dritte Teil dieser Studie durchgeführt, um aktuelle Informationen über die Antibiotikaresistenzen in C. jejuni- Putenisolaten zu erhalten. Dazu wurden auch molekularbiologische Untersuchungen zur Ciprofloxacin-, Tetracyclin- und Erythromycin-Resistenz durchgeführt. Alle Isolate waren empfindlich gegenüber Chloramphenicol und Gentamicin. Die Isolate waren hochgradig resistent gegen Sulfonamide, Metronidazol, Ciprofloxacin, Nalidixinsaure und Tetracyclin. Viele Isolate waren empfindlich gegenüber Streptomycin, Erythromycin, Neomycin und Amoxicillin. Ebenso konnten Mehrfachresistenzen bei verschiedenen Isolaten nachgewiesen werden. Ersatz des Thr-86 → Ile im gyrA-Gen und die Detektion des tet(O)-Gens waren die wichtigsten Resistenzmechanismen für Fluorchinolone und Tetracyclin, Resistenz während keine Punktmutation in der 23S-rRNA-Gen gefunden wurde, die für die Makrolidresistenz verantwortlich gemacht wird. Die vorliegende Studie liefert ausreichend Daten dafür, dass die PCR-RFLP und PCR- MAMA einfache und schnelle Verfahren zum Nachweis der Ciprofloxacin-Resistenz in C. jejuni darstellen und als Alternative für den routinemäßigen Nachweis der Mutation, ohne die Notwendigkeit einer DNA-Sequenzierung dienen können. Die Studie stellt erstmals seit Jahren den aktuellen Status der antimikrobiellen Empfindlichkeit für C. jejuni-Isolate aus Putenhaltungen verschiedener Regionen Deutschlands dar (Kapitel 4). Während der Weg zum Campylobacter aus Blinddarm Inhalte der weiblichen Mastputen zu isolieren, die am 16. Woche im Alter von zwei gramnegative wurden mikroaerophilen, unbewegliche und nicht Sporen bildende Kokken isoliert. Die biochemische Reaktion Profile (API 20 E und API 20 NE) eingegeben beide Stämme als Ochrobactrum anthropi. Auf der Basis der 16S-rRNA-Gen und recA-Gen-Sequenz Ähnlichkeiten wurden die Stämme als Ochrobactrum anthropi und Ochrobactrum pecoris identifiziert sind. Beide Stämme waren resistent gegenüber beta- Lactam-Antibiotika, Chloramphenicol und Sulfonamiden, aber unterschiedlich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Ciprofloxacin, Gentamicin und Tetracyclin. Dies ist das erste Mal, dass Ochrobactrum von einem aviaren Wirt isoliert werden konnte. (Kapitel 5).