Sequencing of alpha- and beta2- toxin-genes from C. perfringens strains isolated from rabbits

Abstract

Rabbit enterocolitis is a serious gastrointestinal syndrome appearing in France since the end of 1996. The disease is characterized by small quantities of watery diarrhoea followed by a decrease in food intake and finally resulting in intestinal paralysis. It has high mortality rates (30-80%) and spreads very rapidly. There is clear experimental evidence that this disease is produced by Clostridium perfringens. Aim of this work is to characterize the genotype of the Clostridium strains circulating in Germany and sequence the major toxin genes. C. perfringens strains were collected from different rabbit livestocks throughout Germany (including 3 from Italy), and isolated from the intestine of sick rabbits. All samples were typed via PCR using consensus primers of the major toxin genes (alpha, beta, epsilon, iota, cpe and beta2). From a total of 71 strains, all contain the alpha-gene and 25 additionally the beta2-gene. Therefore all are type A Clostridium perfringens. The alpha-toxin genes were isolated and sequenced, including their immediate upstream and downstream surroundings. The upstream region contains all elements necessary for expression, i.e. typical bacterial promoter elements for transcription initiation and a Shine-Dalgarno-sequence necessary for translation. No transcriptional termination signals were found at the end of the coding region, suggesting the alpha-toxin gene to be member of an operon. The deduced amino acid differences within the 71 alpha-toxins are low and restricted to certain areas of the protein. All the functionally important amino acid residues, i.e. the ones involved in metal ion-, membrane-binding and in the conformational activation, are conserved in all the 71 alpha–toxins. Therefore, it can be concluded that all alpha- toxins are equally well active. Studies carried on by Gilbert et al., 1997, showed that beta2 toxin-producing strains are associated with animal diseases such as necrotic enteritis in piglets and enterocolitis in horses. Therefore, the beta2-toxin gene, cpb2, was analyzed in the C. perfringens isolated from sick rabbits as well. The strategy applied to obtain the beta2-gene sequences was analogous to that for the alpha-toxin genes, i.e. PCR amplification of the DNA region of interest including upstream and downstream parts of the gene. After finding the correct PCR primers for the amplification of the beta2-toxin gene types it could be shown that from the 25 beta2-toxin genes 16 belong to the so-called “porcine”- and 9 to the “non-porcine”-type. All the “porcine”- and 5 of the “non-porcine”-type genes were sequenced. They contain all regulatory elements necessary for transcription, i.e. promoter elements and “hairpin”-termination signals indicationg that monocistronic mRNAs are produced. 15 of the 16 “porcine”-type beta2-toxin genes display an A-deletion within the putative signal peptide region, expecting an immediate downstream translational stop to occur. Only n°6 (Wallenhorst) has an undisturbed open reading frame and should therefore be expressed as a complete protein. This is for the first time, that a “porcine-type” beta2-toxin gene isolated from Clostridia grown in non-porcine animals has this feature. Due to non-solvable sequencing problems, only 5 of the 9 non-porcine beta2-toxin genes could be sequenced completely. All display an undisturbed open reading frame. Similar as within the alpha-toxin samples, the deduced amino acid differences within each beta2-toxin-type are very low, although being marked between the two groups. From only the nucleotide sequence data no prediction can be made for the expression of the two beta2-toxin genes. Therefore, they were cloned into the bacterial expression vector pASK-IBA6. The cloned genes were expressed as fusion proteins, offering the possibility to purify the recombinant beta2-toxins. After immunizing animals, anti-beta2-toxin-specific antibodies should become available to clarify the problem of the expression of the beta2-toxin genes. Summarizing all the data on all toxin-specific genes, due to their low sequence variability, the development of a toxoid vaccine against rabbit enterocolitis should become feasible.

Die sogenannte “Enterocolitis” des Kaninchens wurde zuerst Ende 1996 in Frankreich beschrieben. Die Erkrankung ist charakterisiert anfangs durch geringfügigen wässrigen Durchfall, gefolgt von reduzierter Nahrungsaufnahme mit am Ende völligen Zusammenbruchs intestinaler Aktivität (Darmlähmung). Mortalitätsraten (30-80%) und die Ausbreitungsgeschwindigkeit sind sehr hoch. Klare experimentelle Evidenz weist auf Clostridium perfringens als den Erreger der Erkrankung hin. Ziel dieser Arbeit ist die Charakterisierung der Toxin Genotypen möglichst vieler in deutschen Kaninchenbeständen kursierender C. perfringens Stämme und die Sequenzierung ihrer Haupttoxin-Gene. 71 C.perfringens Isolate aus infizierten Kaninchenbeständen (68 aus Deutschland, 3 aus Italien) wurden gesammelt und mittels PCR unter Verwendung von „consensus“ Oligonukleotiden, charakteristisch für die Haupttoxin Gene (alpha, ß, ε, i, cpe and beta2), typisiert. Alle 71 Proben enthalten das alpha-Toxin-, 25 zusätzlich das ß2-Toxin-Gen. Daher gehören alle zum Clostridium perfringens Typ-A. Die alpha-Toxin Gene wurden amplifiziert, zum Teil kloniert und anschließend sequenziert, einschließlich der strom-aufwärts und –abwärts Regionen. Die Stromaufwärtsregionen enthalten alle zur Transkription erforderlichen Elemente, wie bakterielle Promotoren und das für die Translation notwendige Shine-Dalgarno-Äquivalent. Am Ende des kodierenden Berichs waren keine Transkriptionsterminationselemente vorhanden, was darauf hinweist, dass das alpha-Toxin Gen Bestandteil eines Operons ist. Was den kodierenden Bereich betrifft, ist zu konstatieren, dass die aus der Nukleotidsequenz abgleiteten Aminosäure-Unterschiede in den 71 alpha-Toxinen gering sind und zudem auf bestimmte Bereiche des Proteins beschränkt bleiben. Alle funktionell wichtigen Aminosäure-Reste, also diejenigen, die involviert sind in Metallionen-, Membranbindung und Aktivierung, sind konserveirt. Daraus ist zu schließen, dass alle 71 alpha-Toxine ähnlich hoch aktiv sind. Studien von Gilbert et al (1997) zeigten, dass beta2-Toxin-Gen enthaltende C. perfingens Stämme mit Enteritiden bei Ferkeln und Pferden assoziiert sind. Deshalb wurden die beta2-Toxin Gene von C.perfringens-Isolaten aus erkrankten Kaninchen ebenfalls analysiert. Die dabei angewandte Strategie entsprach der bei der Charakterisierung der alpha-Toxin Gene verwendeten, d.h., PCR- Amplifizierung der entsprechenden DNA-Region unter Einbeziehung strom-aufwärts und-abwärts liegender Genregionen. Nach zum Teil experimenteller Ermittlung der geeigneten PCR-Starter konnte gezeigt werden, dass von den 25 beta2-Toxin Genen 16 zum sog. „Schwein“- und 9 zum „Nicht-Schwein“-Typ gehören. Alle „Schwein“-Typ- und 5 der 9 „Nicht-Schwein“-Typ beta2-Gene wurden sequenziert. Sie enthalten alle die für die Transkription notwendigen Promoter- und Terminations-elemente, was darauf hinweist, dass eine monocistronische mRNA synthetisiert wird. 15 der 16 „Schwein“-Typ beta2-Toxin Gene zeigen eine A-Deletion innerhalb der Signalpeptid-kodierenden Region, was zu einem sehr schnellen Translationsstop führen sollte. Nur die Probe 6 (Wallenhorst) besitzt einen nicht unterbrochenen offenen Leserahmen, sodass erwartet werden kann, dass hier das komplette beta2-Toxin synthetisiert wird. Dies ist das erste Mal, dass ein „Schwein“-Typ beta2-Toxin Gen von Clostridien, die aus Nicht-Schwein-Tieren isoloiert wurden, eine solche Charakterisitik besitzt. Auf Grund nicht lösbarer Sequenzierprobleme konnten nur 5 der 9 „Nicht- Schwein“-Typ beta2-Toxin Gene komplett sequenziert werden. Alle weisen einen kompletten offenen Leserahmen auf. Ähnlich wie bei den alpha-Toxin Genen sind die Aminosäure-Unterschiede innerhalb der Mitglieder jedes beta2-Toxin-Typs sehr gering, allerdings deutlich zwischen Mitgliedern verschiedener beta2 -Toxin-Typen. Aus den Nukleinsäuresequenzdaten allein kann keine Voraussage über die Synthese der beiden beta2-Toxine getroffen werden. Deshalb wurden die Gene in den bakteriellen Expressionsvektor pASK-IBA6 kloniert. Alle drei Toxin-Gene ließen sich als Fusionsproteine exprimieren. Dadurch bietet sich die Möglichkeit die rekombinanten Toxine aufzureinigen und durch anschließende Immunisierung anti-beta2-Toxin-spezifische Antikörper zu erhalten. Mit ihrer Hilfe sollte sich das Problem der beta2-Toxin-Expression zweifelsfrei klären lassen. Fasst man alle Sequenzdaten über die Toxin-spezifischen Gene zusammen, so sollte auf Grund der geringen Sequenzvariabilität die Entwicklung einer Toxoid-Vakzine gegen die Enterocolitis des Kaninchens machbar sein.