Funktion und Regulation sekretorischer und zellwandassoziierter Proteasen von Candida albicans

Abstract

Über 50 % der gesunden Bevölkerung sind Träger von Pilzen der Gattung Candida. Dazu gehört der häufigste humanpathogene Pilz dieser Gattung: C. albicans. Das Immunsystem und Bakterien der natürlichen mikrobiellen Flora des Menschen sind in der Lage, C. albicans als Kommensale zu kontrollieren. Kommt es jedoch zur Beeinträchtigung der Immunabwehr oder Schädigung der Mikroflora, kann dies zu oberflächlichen, in schweren Fällen auch zu systemischen C. albicans Erkrankungen führen. Die Pathogenese von C. albicans Infektionen wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Auf der Seite des Pilzes sind Virulenzfaktoren, wie zum Beispiel der Dimorphismus, die Adhäsion oder sekretorische, hydrolytische Enzyme von entscheidender Bedeutung. Dazu zählt auch die Familie der sekretorischen Aspartatproteasen. Bisher wurden zehn Mitglieder beschrieben. In silico Studien der vorliegenden Arbeit schließen jedoch die Existenz eines weiteren Mitgliedes nicht aus. Sequenzähnlichkeiten der jeweiligen Sap Proteine und bisherige Untersuchungen zu den Genen SAP1 bis SAP6 deuten auf eine funktionelle Spezialisierung einzelner Subgruppen dieser Familie. Computergestützte Analysen der Promotorregionen aller SAP Gene sprechen aufgrund putativer Transkriptionsfaktorbindestellen für eine differenzielle Regulation der SAP Genexpression. In vitro und in vivo Untersuchungen der SAP Genexpression in verschiedenen Mutanten, denen bestimmte Transkriptionsfaktoren fehlen, bestätigen diese Ergebnisse. Bei dieser Versuchsreihe konnte gezeigt werden, dass die Transkriptionsfaktoren Cph1 und Efg1, welche bei der Regulation des Dimorphismus von zentraler Bedeutung sind, auch an der Expressionsregulation der Gene SAP4 bis SAP6 beteiligt sind. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die abgeschwächte Virulenz von Δcph1 und Δefg1 Mutanten zumindest teilweise auf eine fehlende SAP4 bis SAP6 Expression zurückzuführen ist. Innerhalb der Sap Familie nehmen die beiden Proteasen Sap9 und Sap10 eine Sonderstellung ein. Im Gegensatz zu allen anderen Mitgliedern dieser Familie sind diese Proteasen stark glykosiliert und auf der Zelloberfläche über Glykosylphosphatidylinositol (GPI) verankert. Durch die Herstellung von Protease Gfp Fusionsproteinen konnte eine Zelloberflächenlokalisation bestätigt werden, wobei Sap9 Antigene vorrangig in der Zellmembran und Sap10 Antigene auch in der Zellwand nachgewiesen wurden. Durch Deletion der Gene SAP9 und SAP10 und durch Analyse der entsprechenden Einzel und Doppelmutanten konnte gezeigt werden, dass beide Proteasen sowohl eine wichtige Funktion bei der Integrität der Zelloberfläche haben, als auch an Zelltrennungsprozessen während der Vermehrung durch Sprossung beteiligt sind. Damit konnte erstmals bei Sap Proteasen eine zelluläre Funktion demonstriert werden. Sowohl Sap9, als auch Sap10 schneiden an basischen bzw. dibasischen Sequenzmotiven und weisen ein Prozessierungsmuster auf, welches dem der Yapsine oder der Kex2 Protease aus Saccharomyces cerevisiae ähnelt. Die Überexpression des SAP9 Gens in den Mutanten Δkex2 und Δsap10, bzw. des SAP10 Gens in den Mutanten Δkex2 und Δsap9 von C. albicans führte jedoch nur zu einer teilweisen Wiederherstellung der Wildtyp Phänotypen. Daher muss angenommen werden, dass Sap9 und Sap10 (sowie Kex2) zwar funktionell überlappen, aber verschiedene, spezifische, pilzeigene Substrate prozessieren. Darüber hinaus ist eine Autoprozessierung von Sap9 wahrscheinlich. Weiterhin führt die Deletion von SAP9 und SAP10 zu einem veränderten Adhäsionsverhalten gegenüber oralen Epithelzellen und bewirkt entweder eine verstärkte (Δsap9) oder eine abgeschwächte Adhäsion (Δsap10). Beide Mutanten zeigten jedoch eine signifikant verringerte Fähigkeit, orales Epithelgewebe im oralen Schleimhautmodel zu schädigen. Somit besitzen die Proteasen Sap9 und Sap10 Funktionen, welche sowohl mit zellulären Prozessen, aber auch mit Wirt Pilz Interaktionen assoziiert sind. Auf der Basis der Ergebnisse dieser Arbeit wird postuliert, dass die Proteasen Sap9 und Sap10 Pilzproteine prozessieren, welche an der Zelloberfläche lokalisiert sind oder diese passieren und am strukturellen Aufbau der Zelloberfläche sowie an Adhäsionsprozessen beteiligt sind.

Over 50 % of the healthy population are carriers of fungi of the genus Candida most commonly the pathogenic C. albicans. Bacteria of the natural microbial flora and the immune system are able to keep C. albicans as a commensal. In the case of a weakening of the immune defence or imbalance of the normal micro flora, the development of superficial, or in certain circumstances life threatening systemic, C. albicans infections is possible. C. albicans pathogenicity is influenced by different factors. On the fungal side are virulence attributes, like morphogenesis, adhesion factors and secreted hydrolytic enzymes of vital importance. Among these is the family of secreted aspartic proteases (Saps) of which ten members have so far been described. In silico studies presented in this thesis do not exclude the existence of an additional member. Similarities in sequences of the Sap proteins, and previous studies of the genes SAP1 to SAP6, point at a functional specialisation of certain sub groups of this family. Computer based analysis of putative transcription factor binding sites in the promoter regions of all SAP genes argue for differential regulation of the SAP gene expression. In vitro and in vivo analyses of SAP gene expression in different mutants, lacking certain transcription factors, support these results. Within these studies it was shown that the transcription factors Cph1 and Efg1, which play central roles in the regulation of morphogenesis, are involved in the regulation of the expression of the genes SAP4 to SAP6. These data suggest that the reduced virulence of Δcph1 and Δefg1 mutants is at least partially due to the loss of expression of SAP4 to SAP6. The two proteases Sap9 and Sap10 take an exceptional position within the Sap family. In contrast to all other members of this family, these proteases are heavily glycosylated and localised via glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors at the cell surface. The construction of Protease Gfp fusion proteins verified the localisation at the cell surface of the two proteases, whereby Sap9 antigens were found mainly in the cell membrane and Sap10 antigens additionally in the cell wall. The deletion of the genes SAP9 and SAP10 and the analyses of the resulting single and double mutants led to the conclusions that Sap9 and Sap10 play an important role in cell surface integrity as well as for the cell separation process during budding. With this it has been shown for the first time that Sap proteases have a cellular function. Sap9 und Sap10 cleave at basic or dibasic processing sites and show a processing pattern similar to yapsins or the Kex2 protease from Saccharomyces cerevisiae. The over expression in C. albicans of the SAP9 gene in mutants lacking KEX2 or SAP10, or of the SAP10 gene in mutants lacking KEX2 or SAP9, only partially restored the phenotypes of the wild type. Therefore it must be assumed that Sap9 and Sap10 (as well as Kex2) despite functional overlap, process distinct target proteins of fungal origin. Sap9 may also have an autocatalytic processing activity. Additionally, deletion of these genes leads to altered adhesion properties to buccal epithelial cells and causes either an enhanced (Δsap9) or reduced (Δsap10) adhesion. However, both mutants show significantly reduced tissue damage in an in vitro model of oral epithelial infection. Consequently, Sap9 and Sap10 possess a novel, dual role in both cellular processes and host pathogen interactions. On the basis of the results presented in this thesis it is postulated that Sap9 and Sap10 proteases process proteins which are of fungal origin, are localised at the cell surface or passing through it and are involved in the structural assembly of the cell surface and adhesion.