dc.contributor.author
Hauck, Oliver
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:03:35Z
dc.date.available
2014-07-22T12:41:04.837Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8804
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13003
dc.description.abstract
In dieser Arbeit wurde die Urat-Oxidase-Mutante (uox) von Arabidopsis thaliana
charakterisiert. Urat-Oxidase (UOX) ist ein peroxisomales Enzym des
Purinringkatabolismus, welches die Oxidation von Harnsäure zu 5-Hydroxyisourat
katalysiert. UOX wird während der späten Embryonalentwicklung und im Keimling,
aber auch in Blättern, Wurzeln und Blüten exprimiert. In jeder Nullmutante des
Purinringabbaus akkumuliert das Substrat des betroffenen Enzyms, aber unter
Standardwachstumsbedingungen zeigt nur uox einen auffälligen Phänotyp: Die
Keimungsrate ist verringert und die Keimlinge bleiben auf Erde in einem
unentwickelten Stadium stecken. Die Keimlinge können die Speicherlipide der
Kotyledonen nicht mobilisieren, bilden keine Primärwurzel und die Keimblätter
ergrünen nicht. Daher benötigen sie Zuckerzusatz im Medium, um zur Autotrophie
zu gelangen. Der uox-Phänotyp tritt in der Xanthin-Dehydrogenase-Mutante (xdh)
nicht auf und ist in xdh uox komplett revertiert. Somit ist weder der Ausfall
des Purinringabbaus, noch eine etwaige strukturelle Funktion von UOX in
Peroxisomen für den Phänotyp verantwortlich. Eine kolorimetrische Methode zur
Quantifizierung von Harnsäure in Pflanzengeweben wurde entwickelt und zeigte
ihr Vorkommen ausschließlich in allen Geweben von uox, vor allem aber ihre
Anhäufung in sich entwickelnden Samen. In xdh- und xdh uox-Samen akkumulierte
Xanthin in vergleichbarer Konzentration, ohne einen vom Wildtyp abweichenden
Phänotyp zu verursachen. Im Gegensatz zu anderen Oxopurinen, wie Xanthin, hat
Harnsäure offenbar eine toxische Wirkung auf die Samen- und
Keimlingsentwicklung. Eine Metaboliten-Analyse von Samen wurde durchgeführt.
Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie zeigte einen drastisch
erhöhten Gehalt an Uridin und Sorbitol/Galaktitol in uox. Letzteres deutet auf
starken osmotischen Stress während der Austrocknungsphase der uox Samen hin.
Eine Lipidanalyse mittels Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie zeigte in
uox signifikant mehr freie Fettsäuren aber weniger Glycerophospholipide und
kurzkettige Triacylglyceride verglichen mit Wildtyp- und xdh uox-Samen.
Transmissionselektronenmikroskopie von Kotyledonen aus Samen zeigte eine
veränderte Morphologie der Proteinspeichervakuolen in uox mit Einschlüssen
unbekannter Zusammensetzung, wohingegen xdh uox dem Wildtyp glich.
Gleichzeitig wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Gehalt an
Speicherproteinen, wie Cruciferin, in uox-Samen signifikant verringert
gefunden. Eine konfokalmikroskopische Analyse verschiedener uox-Linien, in
denen die Peroxisomen GFP-markiert waren, zeigte einen fortschreitenden
Verlust der Zahl der punktförmigen GFP Signale während der späten
Samenentwicklung, zeitlich beginnend nach der Harnsäure-Akkumulation. In
Embryonen aus uox-Samen wies die Mehrzahl der Kotyledonen keine oder nur
wenige funktionale Peroxisomen auf. Hypokotyle waren weniger stark betroffen,
hier waren apikal häufig noch GFP-Signale vorhanden. Der peroxisomale Defekt
in uox Kotyledonen wurde durch den zytochemischen Katalasenachweis mit
Diaminobenzidin (DAB) bestätigt. Während Wildtyp und xdh uox vergleichbar
zahlreiche DAB-Signale in Semidünnschnitten von Keimblättern zeigten, fehlten
diese in uox-Präparaten. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit erzielten
Ergebnisse, dass die Harnsäure-Akkumulation während der Samenentwicklung von
uox die wahrscheinliche Ursache für den Funktionsverlust von Peroxisomen in
Kotyledonen und Hypokotylen ist, was dann den Keimungsdefekt in uox-Samen und
das Ausbleiben der Autotrophie bei uox-Keimlingen zur Folge hat.
de
dc.description.abstract
In this study, a urate oxidase mutant of Arabidopsis thaliana (uox) was
characterized. Urate oxidase (UOX) is a peroxisomal enzyme involved in purine
ring catabolism which catalyzes the oxidation of uric acid to
5-hydroxyisourate. UOX is expressed in late embryogenesis and during
germination of the seedling, but also at later stages in leaves, roots and
flower parts. In each of the mutants of purine ring degradation the substrate
of the affected enzyme accumulates, but under standard growth conditions only
uox shows a characteristic phenotype. Its germination rate is low and the
seedlings are arrested in their growth on soil at an early stage. The
seedlings fail to mobilize their lipid reserves and do not develop a primary
root or green cotyledons. Therefore they need an external sugar supply to
become autotrophic. As xdh (the xanthine dehydrogenase mutant) and xdh uox
look normal, the lack of purine degradation itself or a structural function of
UOX in peroxisomes can be ruled out as the cause of the uox phenotype. A
colorimetric method to quantify uric acid in plant tissues was established and
demonstrated its accumulation exclusively in all tissues of uox, but most
prominently in developing and mature seeds. The assay showed a comparable
accumulation of xanthine (the substrate of XDH) in seeds of xdh and xdh uox
without causing any obvious phenotype. Obviously uric acid exerts a toxic
effect during seed and seedling development whereas other oxopurines like
xanthine do not. A metabolic profiling of seeds was performed. Gas
chromatography coupled to mass spectrometry revealed a drastic elevation of
uridine and sorbitol/galactitol in the seeds of uox. The latter indicates
increased osmotic stress during the desiccation phase. Lipid analysis by
ultraperformance liquid chromatography showed a significant increase of free
fatty acids, but a decrease in the content of glycerophospholipids and short-
chain triacylglycerides in uox in comparison to seeds of wild type and xdh
uox. Transmission electron microscopy of cotyledons dissected from seeds
revealed an altered morphology of protein storage vacuoles in uox with
inclusions of unknown composition whereas xdh uox resembled the wild type. At
the same time, with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the content of
storage proteins like cruciferin was found to be significantly lower in uox
seeds. Confocal laser scanning microscopy of uox lines, in which GFP is
targeted to peroxisomes, revealed a progressive loss of punctiform GFP signals
in uox during late seed development, starting after the accumulation of uric
acid. In mature embryos dissected from dry seeds of uox, most cotyledons
contained none or only few functional peroxisomes. Hypocotyls were less
affected, often displaying GFP signals in the apical part. The peroxisomal
defect in cotyledons of uox was confirmed by cytochemical staining for
catalase with diamino benzidine (DAB), which demonstrated numerous DAB-signals
in semi thin sections of cotyledons of wild type and xdh uox but none in
preparations of uox. In summary, the results of this study indicate that the
accumulation of uric acid during seed development in uox is the likely cause
of the loss of peroxisomal function in cotyledons and hypocotyls, which then
leads to the germination defect in seeds of uox and the failure of uox
seedlings to establish.
en
dc.format.extent
X, 98 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
arabidopsis thaliana
dc.subject
germination defect
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Charakterisierung der Urat-Oxidase-Mutante von Arabidopsis thaliana und
Beschreibung eines peroxisomalen Defekts ihrer Embryonen
dc.contributor.contact
oliverhauck@yahoo.de
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. Claus-Peter Witte
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Tina Romeis
dc.date.accepted
2014-07-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097131-5
dc.title.translated
Characterization of the urate oxidase mutant of Arabidopsis thaliana and
description of a peroxisomal defect in its embryos
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097131
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015519
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access