Homogeneity and Stability of Transgene Expression in Mammalian Cells

Abstract

Sustained and homogeneous transgene expression is a prerequisite for many biological studies that rely on the manipulation of genomes by introduction of additional genetic information. However, transgenes stably integrated into a cell s genome are frequently subjected to progressive decrease of their expression over time, and eventually become silenced. This phenomenon has long been noticed and created great attention in both the cell biology and transgenic animal research fields. This is also a serious limitation to gene therapy research. Increasing evidence indicates that heterogeneous or silenced transgene expression is largely caused by epigenetic modulations, in particular, DNA methylation and chromatin modification, on the transgene itself or at the integration site. Epigenetic control is the underlying mechanisms on several regulatory pathways, such as position effect variegation, repeat-induced gene silencing and host defense mechanism. In addition, promoter choices and the nature of the transgene are among other factors contributing to the epigenetic control of transgene expression. The work presented in this thesis focused initially on using a single cell assay (Fluorescence-Activated Cell Scanning, FACS analysis) to determine the effects of single copy integration on the stability of EGFP transgene expression in the Flp recombinase-based transgenic system. By repeatedly targeting the predetermined FRT site in Flp-In 293 cells, sustained and uniform EGFP expression driven either by the viral CMV promoter or the housekeeping EF-1α gene promoter was monitored under antibiotic selective conditions. After removal of the antibiotic from the culture, however, progressive transgene suppression took place. The use of EF-1α housekeeping gene promoter did not show any advantage over the viral CMV promoter to sustain the transgene expression. Moreover, the suppression of the transgene expression was even not ameliorated when substituting the EGFP gene by a novel allele free of CpG dinucleotides (EGFPCpG-). I thereby hypothesized that prokaryotic sequences integrated along with the transgene into the host genome triggered epigenetic modulations at the local chromatin domain, resulting in the transgene region become engrossed by the spreading of heterochromatin structure and gradually being silenced. Additionally, two different regulation modes were observed during the course of transgene silencing: the CMV promoter is associated with the rheostat mode; the EF-1 α promoter has an on/off mode. The newly introduced Sorting-Subcloning approach is designed to obtain EGFP transgene positive clones by bypassing the traditional antibiotic selection. This approach directly selects integration events that escape epigenetic modulations and permit unforced transgene expression. Systematic studies presented in this thesis proved this novel approach is a successful gateway to homogeneous, prolonged, and even enhanced transgene expression. Furthermore, it provides strong evidence that antibiotic selection protocol is a decisive factor contributing to transgene silencing. These results will greatly facilitate transgene studies in cultured cell lines. Future investigation is necessary to decipher how epigenetic modulations are controlled on the integrated transgene sequences. The outcome will facilitate analyzing transcription programs of the transgene without the dominant effect of the epigenetic environment.

Die dauerhafte und homogene Expression, das heißt Transkription und Translation, des Transgens ist die Voraussetzung für biologische Untersuchungen, die auf der genetischen Manipulation des Genoms basieren. Sowohl in der Zellbiologie als auch bei der Forschung mit transgenen Tieren wurde in der Vergangenheit jedoch beobachtet, dass die Expression von stabil in das Genom integrierten Genen im zeitlichen Verlauf häufig abnimmt und letztlich völlig zum Erliegen kommt. Dieses Phänomen, auch als Silencing bezeichnet, stellt u.a. eine ernsthafte Beschränkung für die Gentherapie dar. Zahlreiche Untersuchungen deuten darauf hin, dass die heterogene Expression des Transgens und das Silencing durch epigenetische Veränderungen wie DNA- Methylierung und Chromatin-Modifikationen verursacht werden. Von diesen sind entweder das Transgen selbst oder die direkte Umgebung des Insertionsortes betroffen. Die epigenetische Kontrolle der Genexpression ist ein Regulationsmechanismus, der z.B. der Positionseffekt-Variegation zugrunde liegt, aber auch der durch Wiederholung des gleichen DNA-Abschnitts induzierten Geninaktivierung (repeat-induced gene silencing) und der Pathogen- Abwehr von Wirtszellen. Die epigenetische Kontrolle der Expression des Transgens wird neben anderen Faktoren vor allem durch die Wahl des Promotors und die Eigenschaften des Transgens beeinflusst. Die in dieser Dissertation präsentierte Arbeit konzentrierte sich anfänglich auf Untersuchungen im Flp- Rekombinase-System. Mit Hilfe der FACS-Analyse (Fluorescense-Activated Cell Scanning) sollte erforscht werden, wie sich eine Einzelkopie-Integration auf die Stabilität der Expression eines EGFP-Transgens auswirkt. Nach Insertion der Konstrukte in den FRT-Locus von Flp-In 293-Zellen wurden Stabilität und Homogenität der EGFP-Expression verfolgt. Als Promotoren kamen der virale CMV- Promotor und der Promotor des EF-1-Gens, einem sogenannten housekeeping gene, zum Einsatz. Zunächst wuchsen die Zellen unter selektiven Bedingungen. Wurde das Antibiotikum vom Medium entfernt, so kam es zu einer zunehmenden Unterdrückung der Expression des Transgens. Der EF-1-Promotor zeigte im Vergleich zum CMV-Promotor keinerlei Vorteile in der Beibeheltung der transgene Expression. Dieser Zustand besserte sich nicht, wenn die EGFP-cDNA in den Konstrukten durch eine CpG-freie Version (EGFP CpG-) ersetzt wurde. Desweiteren wurde im Flp-System beobachtet, dass prokaryontische Sequenzen, die als Teil des Transgens in das Genom der Zelle gelangten, offensichtlich zu einer beschleunigten Inaktivierung des FRT-Locus führten. Interessant war die Beobachtung, dass es zwei unterschiedliche Mechanismen der Geninaktivierung gab. Das System mit dem CMV-Promotor war einem Rheostaten vergleichbar, während das mit dem EF-1-Pomotor einem Ein/Aus-Modus unterlag. Weiterhin wurde eine neue Methode (Sorting-Subcloning) entwickelt, die es ohne den traditionellen Einsatz von Selektionsmarkern ermöglicht, transgene, EGFP- positive Klone zu erzeugen. Dabei werden mit Hilfe des FACS Integrationsereignisse selektiert, die keiner epigenetischen Modulation unterliegen und damit das Transgen ungehindert exprimieren können. Die Kultivierung der Klone über mehrere Monate zeigte, dass dieser Ansatz zu einer dauerhaften, homogenen und sogar verbesserten Expression des Transgens führte. Außerdem lieferte dieses Experiment Hinweise darauf, dass Protokolle, die mit der herkömmlichen Selektionsmethode arbeiten, häufiger in der Inaktivierung des Transgens enden. Die in der Arbeit präsentierten Ergebnisse werden die Untersuchung von Transgenen in kultivierten Zellen deutlich erleichtern. Weitere Experimente sind notwendig, um den Mechanismus der epigenetischen Kontrolle von Transgenen zu entschlüsseln. Dies wird die Möglichkeit schaffen, die Transkriptionsprogramme von Transgenen ohne störende epigenetische Effekte zu analysieren.