Einfluss der Hypothermie und STAT3-Inhibition auf die Neuroinflammation in einem Zell-Kultur-Modell mit BV2-Mikrogliazellen

Abstract

Tiefe Hypothermie wird vorwiegend bei herzchirurgischen Eingriffen von komplexen Vitien, in Zusammenhang mit einem intraoperativ notwendigen Herz- Kreislaufstillstand, im Neugeborenen- und Säuglingsalter angewandt. Das Ziel ist den Organismus, und hier insbesondere das Gehirn, mit seiner sehr geringen Toleranz gegenüber Hypoxie vor den schwerwiegenden Folgen einer Organischämie zu schützen. Nach einer Operation kann als gravierende Komplikation ein systemisches inflammatorisches responsives Syndrom (SIRS) auftreten. Vor diesem klinischen Hintergrund wurde ein Zell-Kultur-Modell mit immunkompetenten BV2-Mikrogliazellen etabliert, um die zellulären Mechanismen der Hypothermie und der Inflammationsreaktion zu untersuchen. Durch eine Stimulation mit LPS (Lipopolysaccharid) sollte die durch den kardiopulmonalen Bypass ausgelöste Endotoxinämie, die hauptsächlich durch gram-negative Bakterien verursacht wird, simuliert werden. Die BV2-Mikrogliazellen wurden für vier Stunden mit 1µg/ml LPS stimuliert. Während der Stimulation wurden sie für zwei Stunden auf 17°C gekühlt, innerhalb von zwei Stunden wiedererwärmt und für 24 Stunden nachbeobachtet. Die Zellvitalität wurde mittels FACS- Analyse und MTT-Assay bestimmt, die Proteinanalyse (phospho-STAT3, phospho-NF- κB p65, IκBα, iNOS) erfolgte mittels Western Blot-Technik, die Ausschüttung von IL-6, TNF-α, und MCP-1 wurde mit einem ELISA und die NO-Ausschüttung mit dem Griess-Assay bestimmt. Des Weiteren wurde ein Migrationsassay durchgeführt. Um die Effekte einer phospho-STAT3-Inhibition auf die Sekretion von IL-6 und TNF-α zu untersuchen, wurde der STAT3-Inhibitor Stattic eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass tiefe Hypothermie keinen Einfluss auf die Zellvitalität hat und nicht zur Apoptose führt. Die Ausschüttung der Zytokine IL-6 und TNF-α und des Chemokins MCP-1 war zwei und vier Stunden nach Versuchsbeginn signifikant reduziert. Auch wurde die Proteinexpression von phospho-STAT3 durch die Kühlung (zwei Stunden nach Versuchsbeginn) signifikant reduziert. Tiefe Hypothermie konnte die Migration von phospho-NF-κB p65 in den Zellkern kurzfristig (30 Minuten nach Versuchsstart) vermindern und auch die Degradation von IκBα signifikant senken. Im Migrationsassay war eine verminderte, jedoch nicht statistisch signifikante Migration der BV2-Zellen in den gekühlten Versuchsgruppen zu beobachten, während die Expression von ICAM-1 nicht von der Kühlung beeinflusst wurde. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine vierstündige Inkubation mit dem STAT3-Inhibitor Stattic dieselben Effekte auf die IL-6- und TNF-α-Sekretion hatte wie Kühlung und Wiedererwärmung. Zusammenfassend schwächte tiefe Hypothermie in BV2-Mikrogliazellen die durch LPS induzierte Inflammationsreaktion ab. Dieser Effekt war nach 28 Stunden nicht mehr nachweisbar. Dennoch könnte die Abschwächung der Inflammationsreaktion in BV2-Mikrogliazllen ein möglicher Mechanismus der durch die Hypothermie vermittelten Neuroprotektion sein. Stattic hat in Hinblick auf die IL-6- und TNF-α-Ausschüttung dieselben Effekte wie tiefe Hypothermie, sodass Stattic ein aussichtsreicher Kandidat zur Imitation der protektiven Wirkung der Kühlung zu sein scheint.

Deep therapeutic hypothermia is a standard method for neuroprotection during complex pediatric cardiac surgery involving extracorporeal circulation and deep hypothermic cardiac arrest (DHCA). As the brain is the organ with the shortest ischemia time. The procedure, however, can provoke the vigorous systemic inflammatory response syndrome (SIRS), one of the most severe side effects associated with pediatric cardiac surgery. To date, the cellular inflammatory mechanisms induced by deep hypothermia remain to be elucidated. Therefore, the effects of deep hypothermia and rewarming on an immortalized murine microglial cell line (BV2) stimulated with lipopolysaccharide (LPS) (Escherichia coli) were investigated in this project. BV2-microglial cells were exposed to 17°C for 2 hours, rewarmed to 37 °C within 2 hours, and observed under normothermic conditions for an additional 24 hours. In order to simulate cardiopulmonary bypass conditions, the BV2-microglial cells were stimulated with 1 µg/ml LPS for 4 hours. Cells were stained with 4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) and isolectin B4 for morphological analysis, and cell viability was quantified by MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-iphenyltetrazoliumbromid) and FACS analysis. Protein expressions (phospho-STAT3, phospho-NF-κB p65, IκBα, iNOS) were quantified by Western blotting and microglial migration was quantified by a migration assay. IL-6, TNF-α, and MCP-1 secretions were measured by ELISA. Additionally, Stattic (STAT3 activation inhibitor) was used to investigate the effects on IL-6 and TNF-α expressions. Stattic was applied for 4 hours in place of deep hypothermia and rewarming. Cell viability was observed to be temperature independent during the experimental period (28 hours). However, deep hypothermia led to morphological changes from a ramified and resting status under 37°C to amoeboid shaped cells under 17°C, even without LPS stimulation. IL-6, TNF-α, and MCP-1 secretions were significantly decreased 4 hours after the start of the experiment in the hypothermic group. The migration of phospho-NF-κB p65 was attenuated (30 minutes) and the IκBα degradation was delayed (2 hours) by deep hypothermia. Phospho-Stat3 expression was observed to be significantly down-regulated under deep hypothermic conditions, corresponding with the significant reduction in IL-6 and TNF-α expressions. Although not statistically significant, hypothermia appeared to attenuate microglial migration. Similar to the effects of hypothermia, the application of Stattic under normothermic conditions resulted in significantly reduced IL-6 and TNF-α expressions. Hypothermia reduces the inflammatory responses in LPS stimulated BV2-microglial cells, eluding to a possible mechanism of hypothermia-induced neuroprotection. In the future, attenuating IL-6 and TNF-α expressions by blocking the phospho-STAT3 may lead to the development of a neuroprotectant with a higher chance of showing clinical benefit.