microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that are crucial regulators of carcinogenesis. In this thesis, the deregulation of miRNAs in prostate cancer was investigated. miRNA microarray profiling was performed in fresh frozen prostate cancer and matched normal adjacent tissues. Differentially expressed miRNAs were subsequently validated by real-time quantitative PCR (RT-qPCR). Fifteen miRNAs differentially regulated in prostate cancer in comparison with normal tissue. Expression of 5 miRNAs was correlated with the pathological stage and the Gleason score. The diagnostic potential was calculated by receiver operating characteristic curves and logistic regression. Two miRNAs alone correctly classified 84% of malignant and non-malignant samples. The prognostic value of the miRNAs in prostate cancer specimens after radical prostatectomy was calculated by a Kaplan-Meier analysis and a multivariate Cox regression analysis. miR-96 expression was associated with biochemical relapse, which is defined as an increased value of prostate-specific antigen after surgery and which is indicative of prostate cancer recurrence. The prognostic value of miR-96 was validated with an independent sample set. The multivariate Cox regression analysis confirmed that miR-96 expression is an independent marker of biochemical relapse. To further identify miRNAs concurrent with a biochemical relapse, miRNA profiling was performed in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues from biochemical relapse patients. The deregulation of miR-10b and miR-222 in patients experiencing an early biochemical relapse was validated by RT-qPCR. Based on the profiling studies and the important role of miR-96 as a prognostic marker, miR-96 function was investigated. miR-96 overexpression increased proliferation and impaired apoptosis of LNCaP prostate cancer cells upon induction by camptothecin. In- silico target prediction identified putative apoptosis-related target genes, among them FOXO1 and ITPR1. The direct binding of miR-96 to the FOXO1 3’ UTR was shown by a reporter gene assay and resulted in a downregulation of the FOXO1 transcript and protein. The binding of miR-96 to the ITPR1 3’ UTR was only shown for the second predicted binding site. miR-96 expression was inversely correlated with FOXO1 protein expression in prostate cancer and matched normal adjacent tissue. A second miRNA, miR-133b, was functionally characterized in this thesis. A collaborating group has previously identified miR-133b as a regulator of extrinsic apoptosis. In this thesis, miR-133b is shown to be downregulated in prostate cancer and an overexpression of miR-133b in PC3 prostate cancer cells is described to impair proliferation. Microarray profiling revealed that an abundance of genes was downregulated upon miR-133b transfection. The downregulation of GSTP1, FAIM, CAV1 and VEGFC was verified on transcript and protein levels. The direct binding of miR-133b to the CAV1 3’ UTR was not detected in a reporter gene assay, suggesting an indirect regulation. miR-133b and FAIM transcript expression were inversely correlated, whereas all other target genes were not correlated with miR-133b expression. Therefore the regulation of these genes by miR-133b might be superimposed by other regulatory mechanisms in prostate cancer. This thesis provides evidence of the miRNA deregulation in prostate cancer and that differential miRNAs are useful diagnostic and prognostic indicators. Furthermore, the regulatory roles of miR-96 and miR-133b in apoptosis and proliferation in prostate cancer cells are established for the first time in this cancer entity. These roles provide new insights into prostate cancer carcinogenesis.
miRNAs sind kurze nicht-protein-kodierende RNAs und wichtige Regulatoren der Karzinogenese. In dieser Arbeit wurde die miRNA-Expression im Prostatakarzinom untersucht. Mit einem Microarray wurde ein miRNA-Profil in gepaartem Prostata- und angrenzendem Normalgewebe erstellt und mittels RT-qPCR validiert. 15 miRNAs waren im Prostatakarzinom unterschiedlich exprimiert. Die Expression von 5 miRNAs korrelierte mit dem histologischen Differenzierungsgrad nach Gleason und dem pathologischen Tumorstadium. Das diagnostische Potential aller miRNAs wurde mit Hilfe von „Receiver Operating Characteristics“ Kurven und logistischer Regression berechnet. Schon die Kombination zweier miRNAs konnte 84% aller malignen und nicht-malignen Proben richtig klassifizieren. Die Expression der miR-96 war in der Kaplan-Meier-Analyse mit einem biochemischen Rezidiv, definiert als Wiederanstieg des prostataspezifischen Antigens nach radikaler Prostatektomie, assoziiert. Der prognostische Wert dieser miRNA wurde in einer unabhängigen Kohorte validiert. Multivariate Cox Regressionsanalysen bestätigten, dass die Expression der miR-96 ein unabhängiger Marker für ein biochemisches Rezidiv ist. Um weitere miRNAs zu identifizieren, die mit einem biochemischen Rezidiv assoziiert sind, wurde ein miRNA-Profil aus formalin-fixierten, paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken von Patienten mit einem biochemischen Rezidiv erstellt. Die Deregulation der miR- 10b und miR-222 in Patienten mit einem frühen Rezidiv wurde in der RT-qPCR bestätigt. Auf Grund der Assoziation der miR-96 mit einem biochemischen Rezidiv wurde die Funktion der miR-96 im Prostatakarzinom untersucht. Induzierte miR-96-Überexpression in LNCaP-Zellen erhöhte deren Proliferation und inhibierte die Apoptose in Camptothecin-behandelten Zellen. Durch in- silico Prädiktion wurden mögliche Apoptose-assoziierte Zielgene identifiziert, unter ihnen FOXO1 und ITPR1. Im Reportergenassay wurde eine direkte Bindung zwischen der miR-96 und der FOXO1 3’-UTR bewiesen, welche mit einer verminderten FOXO1 Transkript- und Proteinexpression einherging. Die Expression miR-96 war invers mit der FOXO1-Protein-Expression im Prostatakarzinomgewebe korreliert. Eine Bindung der miR-96 an die ITPR1 3’-UTR konnte nur für die zweite Bindungsstelle nachgewiesen werden. Weiterhin wurde die Funktion der miR-133b im Prostatakarzinom untersucht. Eine Studie unserer Projektpartner hatte die regulatorische Funktion der miR-133b während der extrinsischen Apoptose untersucht. In dieser Arbeit wurde eine verminderte Expression der miR-133b im Prostatakarzinom nachgewiesen. Die Überexpression dieser miRNA in PC3-Zellen inhibierte die Proliferation. In einem Microarray war eine Vielzahl von Genen in miR-133b überexprimierenden PC3-Zellen vermindert exprimiert. Die verminderte Expression von GSTP1, FAIM, FASN, CAV1 und VEGFC wurde auf Transkript- und Proteinebene verifiziert. Jedoch konnte keine direkte Bindung der miR-133b an die CAV1 3’-UTR nachgewiesen werden, was auf ein indirekte Regulation hindeutet. Die Expression der miR-133b und FAIM korrelierte invers in Prostatageweben. Andere Zielgene waren nicht invers mit der miRNA korreliert, vermutlich weil die Regulation der miR-133b durch andere Regulationsmechanism überdeckt wird. Diese Arbeit beweist, dass das Prostatakarzinom durch ein verändertes miRNA-Expressionsmuster charakterisiert werden kann und dass miRNAs als diagnostische oder prognostische Marker geeignet sind. Zudem wurde zum ersten Mal eine funktionelle Bedeutung der miR-96 und miR-133b im Prostatakarzinom nachgewiesen. Damit vermittelt diese Arbeit neue Einblicke in die Karzinogenese des Prostatakarzinoms.