Eine molekulare und zellbiologische Untersuchung potentieller Brustkrebskandidaten durch 3D-Kulturen

Abstract

Brustkrebs ist die häufigste Krebsart bei Frauen weltweit und machte 2012 ca. 25 % der Krebsneudiagnosen bei Frauen aus. Ein wichtiges Modell für die Erforschung von Brustkrebs ist die dreidimensionale Zellkultur (3D-Kultur). Hierbei werden Brustepithelzellen in eine extrazelluläre Matrix gebettet, wodurch sie drüsenartige Sphäroide, Acini genannt, ausbilden. Dies spiegelt die Drüsenbildung der Brust wider und ermöglicht eine bessere Untersuchung der in vivo-Eigenschaften von Brustepithelzellen im Vergleich zur normalen einschichtigen Zellkultur. Dieses experimentelle System dient auch der Analyse bestimmter Teilaspekte der Brustkrebsentwicklung. Basierend auf diesem Modell, wurde zum einen eine genomweite Genexpressionsanalyse verschiedener Stadien der MCF10A-Acini-Entwicklung durchgeführt, um die molekularen Grundlagen der Brustdrüsenentwicklung zu untersuchen. Um diese Ergebnisse zu ergänzen, wurde zum anderen eine RPPA-Analyse wichtiger Signalproteine der verschiedenen Acini-Stadien durchgeführt. Anhand dieser Ergebnisse wurden potentielle Zielgene ausgewählt und auf ihre mögliche Funktion für die Brustkrebsentstehung analysiert. So zeigten sich TNFRSF6B und DAPL1, aufgrund ihrer starken Regulation während der Acini-Entwicklung und ihrer Funktion für die Apoptose, als gute Kandidaten für weitere Untersuchungen. Es wurden MCF10A-Überexpressionszelllinien hergestellt und deren Reaktion auf eine Fas Ligand-Behandlung getestet. Fas Ligand induziert durch die Bindung an den Fas- Rezeptor den extrinsischen Apoptoseweg und spielt eine wichtige Rolle für die Tumorprogression. Hierbei konnten wir eine mögliche anti-apoptotische Funktion von DAPL1 während der Fas Ligand-induzierten Apoptose feststellen. Zudem wurde der Einfluss der Überexpression und eines Knock-downs der Kandidatengene auf die Acini-Entwicklung analysiert. Dies zeigte jedoch keine direkte Rolle von TNFRSF6B oder DAPL1 für die Acini-Entwicklung. Ein weiterer Fokus dieser Studie liegt auf der Untersuchung der Epithel-Stroma-Interaktion, da diese eine wichtige Rolle für die Krebsentstehung spielt. Hierfür wurden eine normale und eine Tumor-assoziierte Brust-Fibroblastenzelllinie gleichen Ursprungs herangezogen. Diese wurden zunächst mittels Western Blot im direkten Vergleich auf ihre Proteinexpression untersucht, wobei die Tumor-assoziierte Zelllinie eine endogene Überexpression von TNFRSF6B zeigte. Aufgrund dessen wurde die Zellviabilität der Fibroblasten nach Fas Ligand-Behandlung untersucht. Zudem wurden die Fibroblasten mit verschiedenen Wirkstoffen behandelt, die in unterschiedlichen Krebssignalwegen wirken, um ihre Reaktion mittels RPPA-Analyse verschiedener Signalproteine zu testen. Anschließend wurden die Fibroblasten mit MCF10A-Zellen in 3D co-kultiviert. Jedoch zeigten die Fibroblasten keinen deutlichen Einfluss bzw. transformative Eigenschaften während der Acini-Entwicklung. Trotz der häufigen Überexpression von TNFRSF6B in Brustkrebs ist dessen Rolle weiterhin nicht vollständig geklärt.

Breast cancer is one of the most common cancers in women worldwide and accounted for 25 % of all new female cancers in 2012. The three-dimensional cell culture is an important model to study breast cancer. Therefor breast epithelial cells are embedded into an extracellular matrix thus forming glandular-like structures called acini. This resembles the glandular organization of breast tissue and helps to approximate the in vivo properties of cells and their growth and signaling behavior in comparison to normal monolayer cell cultures. Based on this model we performed a whole genome mRNA- profiling of different stages of MCF10A-acinus-formation to investigate the molecular basis of mammary gland development. To complement these results we used RPPA to analyze the regulation of important signaling proteins at the different stages of acini-formation. On the basis of these results the target genes TNFRSF6B and DAPL1 were picked for further analysis. Both showed a high regulation during acini-development and are involved in apoptosis. MCF10A- overexpression cell lines were made to analyze their reaction on Fas ligand treatment. Fas ligand induces the extrinsic pathway of apoptosis via the binding of Fas-receptor and plays a critical role in cancer progression. Here we show a potential role of DAPL1 as an anti-apoptotic protein during Fas ligand-induced apoptosis. Furthermore we investigated the influence of overexpression and knock-down of the target genes on acini-formation but without convincing results. Another focus of this study was the investigation of stromal-epithelial-interaction as it has a great impact on cancer development. Therefor a normal (from tumor-adjacent tissue) and a tumor- associated mammary fibroblast cell line of the same origin were used. A direct comparison of protein expression via Western blot showed the tumor-associated cell line overexpressing TNFRSF6B endogenously. Therefor cell viability of fibroblasts was measured after Fas ligand treatment. Furthermore fibroblasts were treated with different compounds that affect different cancer signaling pathways to test their reaction via RPPA of several signaling proteins. Additionally the influence or transformation potential of the fibroblasts during acini-development was analyzed by 3D-co-culture with MCF10A cells but the fibroblasts did not show a convincing influence on acini-formation. Although TNFRSF6B is often overexpressed its role in breast cancer still remains largely unexplained.