DNA-Spaltung durch Kupfer(II)cyclen-basierte Metallonukleasen: Einfluss von Heteroatomaustausch und Interkalatorsubstitution

Abstract

Krebserkrankungen sind weltweit die zweithäufigste Todesursache. Während sie durch Mutationen der DNA ausgelöst werden, kann die gezielte Veränderung oder Zerstörung von DNA dazu führen, dass die Krebszelle abstirbt. So wurden Krebserkrankungen seit 1978 unter anderem sehr erfolgreich mit DNA-bindenden Medikamenten wie Cisplatin behandelt. Immer häufiger auftretende Resistenzen und Nebenwirkungen altgedienter Krebsmedikamente verlangen die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Kandidaten für neue Medikamente gegen Krebs sind künstliche Nukleasen, die reaktive Sauerstoffspezies generieren und DNA oxidativ spalten können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Strategien genutzt, um ausgehend vom Kupfer(II)cyclen-Komplex neue effektive Metallonukleasen herzustellen. Zunächst wurde untersucht, inwiefern der sukzessive Heteroatomaustausch der Cyclenstickstoffatome die Nukleaseaktivität des Komplexes beeinflusst. Es wurden zehn verschiedene makrozyklische Kupfer(II)-Komplexe mit [NAXB]-Donorsystem dargestellt, bei denen vom Kupfer(II)cyclen-Komplex (A = 4; B = 0) bis hin zum kompletten Sauerstoffanalogon (X = O; A = 0; B = 4) und Schwefelanalogon (X = S; A = 0; B = 4) alle Komplexe charakterisiert und über Agarose-Gelelektrophorese auf ihre Nukleaseaktivität hin untersucht wurden. Die Untersuchung der Sauerstoffanaloga des Cyclens brachte hervor, dass die Nukleaseaktivität gegenüber dem Kupfer(II)cyclen-Komplex erhöht ist und vom Sauerstoffanteil und der Komplexgeometrie abhängt. Durch elektrochemische Untersuchungen konnte der Grund für dieses Verhalten festgestellt werden: Keiner der Kupfer(II )oxacyclen-Komplexe zeigte eine elektrochemisch reversible Reduktion, vielmehr führt die Reduktion zur Freisetzung von Kupfer(I). Es wird vermutet, dass dieses „freie Kupfer“ zur DNA-Spaltung beiträgt. Im Gegensatz dazu bilden die Schwelfelanaloga sowohl stabile Kupfer(II)- als auch Kupfer(I)-Komplexe. Sie können elektrochemisch reversibel reduziert werden und weisen im Vergleich mit der Ausgangsverbindung Kupfer(II)cyclen eine verbesserte DNA-Spaltaktivität auf. Die DNA-Affinität des Kupfer(II)cyclen-Komplexes und seine photochemische und oxidative DNA-Spaltaktivität konnte zudem durch die Substitution mit der DNA-Targetingfunktion Anthrachinon erhöht werden. Hierbei konnte durch die Untersuchung von Komplexen mit verschiedenen Linkerlängen zwischen Cyclenkomplex und Anthrachinongruppe gezeigt werden, dass die Substitution mit der Targetinggruppe die DNA-Spaltaktivität erhöht, jedoch keine direkte Korrelation zwischen DNA-Affinität und DNA-Spaltaktivität besteht. So führt die Substitution mit mehreren Anthrachinongruppen zum Beispiel zu einer Erhöhung der DNA-Affinität, jedoch konnte über Rasterkraftmikroskopie gezeigt werden, dass anstatt einer erhöhten DNA-Spaltaktivität die Vernetzung verschiedener DNA-Stränge erreicht wird. Die mit der DNA-Vernetzung einhergehende Veränderung der DNA-Struktur führt zusätzlich dazu, dass einige der mehrfachsubstituierten Anthrachinonkomplexe die DNA-Synthese bereits in nM-Konzentrationen zum Erliegen bringen können. Zytotoxizitätsuntersuchungen konnten die biologische Aktivität dieser Komplexe auch in Krebszellen bestätigen.

Cancer is among the two leading causes of death worldwide. While mutations of DNA are causing cancer, wilful modification of the DNA structure and its damage can cause death of cancer cells. In this fashion the DNA alkylating agent cisplatin has been used for the treatment of cancer since 1978. Dose- limiting side effects and the increasing resistance of some cancer types against certain drugs call for the development of novel treatments. Among the candidates of such new drugs are metallonucleases, which generate reactive oxygen species and thus promote the oxidative cleavage of DNA. In the line of the present thesis two approaches for the development of new artificial nucleases starting from copper(II) cyclen have been employed: First the effect of the gradual exchange of the macrocyclic heteroatoms on the nuclease activity of the respective complexes was investigated. Ten different copper(II) complexes with [NAXB] donor sets were synthesized and characterized, resulting in a series of complexes ranging from copper(II) cyclen (A = 4; B = 0) over the all oxygen complex (X = O; A = 0; B = 4) to the all sulphur complex (X = S; A = 0; B = 4). These complexes were subjected to DNA cleavage experiments under reducing conditions. After incubation the samples were analysed by agarose gel electrophoresis. Opposite to the copper(II) cyclen complex the oxygen containing complexes showed an increasing DNA cleavage activity that is dependent on both the geometry and the oxygen content of the respective complex. The assessment of the complexes by electrochemical measurements revealed that the reduction of the copper(II) complexes to the corresponding copper(I) species is electrochemically irreversible and leads to the release of free copper(I) ions. Complexes with higher oxygen content have a lower affinity to the copper(I) species and are more prone to release copper. Assumedly it is the free copper species that is catalytically active and causes the DNA cleavage. In contrast to the complexes of oxygen-containing ligands the sulphur containing complexes show electrochemically reversible reduction and are more efficient nucleases than the copper(II) cyclen complex. Secondly the DNA affinity of the copper(II) cyclen complex along with its photochemical and oxidative cleavage activity was improved by substituting it with the DNA targeting function anthraquinone. While the substitution with this targeting group increases the DNA cleavage activity of the copper(II) cyclen complex substantially, the linker length has only impact on DNA affinity, but not on cleavage activity. While substitution of the cyclen moiety with several targeting groups increases DNA affinity, in place of an increase of DNA cleavage activity these complexes are crosslinking different DNA strands as could be shown by atomic force microscopy. Along with this alteration of the DNA structure the DNA synthesis is inhibited at even nanomolar complex concentrations. Cytotoxicity experiments prove that this activity is retained even in cancer cells.