Development and application of in vitro and in vivo microdialysis methods contributing to biomarker profiling and characterisation of drug distribution processes

Abstract

Cytokines as immunomodulatory proteins are secreted by immune and tissue cells mediating immune responses, e.g. inflammation. The use of microdialysis as a minimally invasive technique for sampling interstitial fluid might provide the basis for biomarker profiling for diseases and therapy monitoring. The objectives of this thesis were to develop reproducible bioanalytical methods and apply them to define feasibility and applicability limits for the quantification of cytokines in microdialysate. A commercially available, flow- cytometry based cytokine assay for the four selected model cytokines Interleukin-6 (pro-), Interleukin-8 (pro-), Interleukin-10 (anti-) and Tumour Necrosis Factor-alpha (proinflammatory), which was previously adapted to microdialysate as the respective matrix, was successfully validated for the physiologically relevant concentration range of 5-10000 pg/mL. In vitro microdialysis recovery and delivery investigations were performed utilising a standardised system. System suitability was investigated exploring analyte adsorption, pH effects, the influence of cytokine concentration and of temperature of the catheter-surrounding medium on the relative recovery. A mixture of Ringer’s solution and human albumin solution (0.5%) was used as microperfusate and catheter-surrounding medium. Microdialysate was sampled using linear catheters at flow rates of 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, and 5.0 µL/min. All samples were measured using the validated flow-cytometry method adapted to µDialysate. In vitro investigations confirmed the similarity of gain and loss of only Interleukin-8 via the microdialysis membrane. Delivery investigation of the remaining cytokines partly revealed implausible results, which led to the conclusion that the method of retrodialysis for in vivo catheter calibration of cytokines has to be excluded for clinical studies with microdialysis. Consequently, the flow-rate-variation method was applied for the calibration of the microdialysis catheters in the subsequent in vivo investigation. Moreover, individual cytokine concentrations in microdialysate were observed over a period of three days. The in vivo long-term microdialysis setting was evaluated to be feasible for clinical studies. The study sampling schedule was critically checked and assessed as requiring optimisation. An alternative schedule was worked out and proposed for future clinical trials investigating microdialysis of the four model cytokines. Furthermore, this approach and investigation have in future to be extended to the population of patients with diseases predominantly effecting special tissues. For example, the potential of cytokine concentration measurement as a biomarker monitoring in infected tissues should be evaluated. Another approach to increase understanding of drug distribution processes by the application of microdialysis to optimise drug therapy was acquired. In addition to the systemic exposure, concentrations of the antifungal agent voriconazole were monitored in the abdominal subcutaneous adipose tissue. In this clinical study, voriconazole showed an extensive distribution to the investigated target site. However, high variability was observed in drug distribution as well as in the systemic and target-site drug accumulation for the nine healthy volunteers. Genotyping of the polymorphic metabolic isoenzymes CYP2C9 and CYP2C9 revealed data for the preliminary assessment of an effect on VRC exposure. Especially for the polymorphism of CYP2C19, an essential influence on the systemic as well as the peripheral drug clearance was indicated by the current results. The further evaluation of microdialysis of cytokines as biomarkers and the combination of both investigated approaches will potentially contribute to the optimisation of currently applied (antiinfective) drug therapies.

Zytokine werden im Zuge der Immunantwort, z.B. im Rahmen einer Entzündung, als mediatorische Proteine von Immun- sowie Gewebszellen sezerniert. Die Mikrodialyse als minimal-invasive Technologie zur Gewinnung interstitieller Flüssigkeit kann eine Grundlage für die Erstellung von Biomarkerprofilen für Erkrankungen und deren Therapieüberwachung bilden. Die Zielstellung der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung einer reproduzierbaren bioanalytischen Methode und ihrer Anwendung zur Evaluierung der Umsetzbarkeit einer Quantifizierung von Zytokinen aus dem Mikrodialysat. Ein kommerziell erhältlicher, durchflusszytometrischer Assay für die ausgewählten proinflammatorischen Modelzytokine Interleukin-6, Interleukin-8 und den antiinflammatorischen Mediatoren Interleukin-10 und Tumornekrosefaktor-alpha konnte erfolgreich für den physiologischen Konzentrationsbereich von 5 bis 10000 pg/mL validiert werden, nachdem er zuvor systematisch auf die Anforderungen des Mikrodialysats als relevante Matrix angepasst worden war. In-vitro-Mikrodialyseuntersuchungen zur Zytokingewinnung und –freisetzung über die Mikrodialysemembran wurden an einem standardisiertem Mikrodialysesystem durchgeführt. Die Eignung der Systemparameter wurde anhand von Analytadsorptionserscheinungen an Mikrodialyskatheteroberflächen, von pH- Effekten, und des Einflusses von variierenden Zytokinkonzentrationen und der Temperatur des katheterumgebenden Mediums auf die sogenannte ‘Recovery’ untersucht. Eine mit Humanalbuminlösung versetzte Ringerlösung, welche einen Albumingehalt von 0.5 % aufwies, wurde als Mikroperfusat und äußeres Untersuchungsmedium für die Mikrodialyse eingesetzt. Die Untersuchungen wurden mit linearen Mikrodialysekathetern und bei Fließgeschwindigkeiten von 0.3, 0.5, 1.0, 2.0 und 5.0 µL/min durchgeführt. Die In-vitro-Experimente konnten die Annahme des gleichen Analytaustauschs in beide Richtungen über die Mikrodialysemembran (Rate der Gewinnung gleich der der Freisetzung) ausschließlich für Interleukin-8 bestätigen. Die Versuche zur Analytfreisetzung der restlichen Zytokine zeigten mitunter implausible Ergebnisse, was zur der Schlussfolgerung führte, dass die übliche In-vivo- Kalibiermethode für Mikrodialysekatheter, die Retrodialyse, nicht für die klinischen Anwendung der Mikrodialyse von Zytokinen geeignet ist. Daraufhin wurde die sogenannte ‘Flow-rate-variation method’, eine schrittweise Variierung der Fließgeschwindigkeit, für die In-vivo-Studie angewendet. Daneben wurden die individuellen Zytokinkonzentrationen der über drei aufeinanderfolgende Tage gewonnenen Mikrodialysatproben analysiert. Das zur Langzeitanwendung entwickelte Mikrodialysesystem erwies sich als geeignet für klinische Studien. Das Probenentnahmeschema wurde kritisch evaluiert und Vorschläge zur Optimierung in künftigen Studien zur Gewinnung der vier Modelzytokine wurden aufgezeigt. Darüber hinaus sollte die Überwachung von Zytokinkonzentrationen auf Patientenpopulationen mit beispielsweise mikrobiell infiziertem Gewebe ausgeweitet und auf ihre mögliche Anwendbarkeit als prädiktive Biomarkererhebung überprüft werden. Als weitere Option der Optimisierung von Arzneimitteltherapien wurde die Mikrodialyse zur Untersuchung der Arzneistoffdistribution ins periphere Gewebe angewendet. Konzentrationen des Antimykotikums Voriconazol wurden sowohl systemisch als auch im subkutanen Fettgewebe des Unterbauchs bestimmt und miteinander verglichen. Voriconazol zeigte in dieser klinischen Studie eine ausgeprägte Verteilung in das untersuchte Gewebe, in welchem die Zielerreger für die Arzneimitteltherapie häufig lokalisiert sind. Jedoch wurde eine hohe Variabilität dieser Arzneistoffverteilung sowie der Akkumulation im System und im Zielgewebe zwischen den Probanden festgestellt. Die zusätzliche Genotypisierung der Probanden hinsichtlich des Polymorphismus des metabolisierenden Isoenzyms CYP2C19 lieferte eingeschränkt evaluierbare Daten zum Einfluss auf die individuelle Voriconazolexposition. Die präsentierten Ergebnisse konnten einen merklichen Einfluss auf die zentrale und periphere Arzneistoffclearance zeigen. Eine weitere Evaluierung der Mikrodialyse zur Gewinnung von Zytokinen im Rahmen einer Biomarkerüberwachung und die Kombination dieser Kontrolle von Krankheits- bzw. Therapieeffekten und der Überprüfung von Arzneistoffkonzentrationen im Zielgewebe können einen wichtigen Beitrag zur Optimierung von vorhandenen antiinfektiven Arzneimitteltherapien leisten.