Charakterisierung der viralen Inhibition des Interferon beta-Induktionssystems und Identifikation interferon-modulierender Gene des Maus-Cytomegalovirus

Abstract

Die Untersuchungen bezüglich der Interaktionen zwischen MCMV und der IFNalpha /beta-Induktion zeigten, dass in infizierten Zellen nach der Erkennung viraler Komponenten die IFNalpha/beta-induzierenden Signalwege aktiviert werden, um die IFN-Produktion zu initiieren. Durch MCMV-kodierte Evasionsmechanismen wird die Expression der IFNalpha/beta-Gene schnell und effizient abgeschaltet, so dass nur während einer transienten Phase die Synthese von Typ I Interferonen stattfindet. Da die IFN-Produktion auf der Ebene der Transkription maßgeblich reguliert wird, antagonisiert MCMV die Aktivierung der involvierten Transkriptionsfaktoren IRF3, NF-kappaB und ATF-2/c-Jun. Die Inhibition beruht auf der Wirkung neu synthetisierter viraler Genprodukte, da die Infektion mit UV-inaktivierten Virionen nicht zu dem beobachteten inhibitorischen Effekt führt. Koinfektionsexperimente mit Sendai-Virus zeigten, dass dieser Evasionsmechanismus auf einer aktiven Inhibition durch MCMV basiert. Mit Hilfe der MCMV-Mutante DeltaM27, die nicht mehr in der Lage ist, die Jak/STAT- Kaskade zu inhibieren, wurde gezeigt, dass die initiale Phase der IFNbeta- Induktion und die anschließende Inhibition unabhängig sind von der positiven Rückkopplungsschleife. Zusammengenommen lässt sich schlussfolgern, dass die MCMV-vermittelte Abschaltung der Expression von Typ I-Interferonen in Fibroblasten auf mehreren Inhibitionsmechanismen basiert, die alle bekannten Signalwege ausschalten, die an der Bildung des IFNbeta-Enhanceosoms beteiligt sind. Durch die systematische Analyse von Deletionsmutanten wurde die erste MCMV-Mutante mit defekter IFNbeta-Inhibition identifiziert. DeltaM43-MCMV wies einen selektiven Defekt der IFNbeta-Inhibition bei intakter IFNalpha4-Inhibition auf. Um Einblicke in den Mechanismus dieser Inhibition zu erhalten, wurde die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren des IFNbeta- Enhanceosoms analysiert. DeltaM43-MCMV war nicht beeinträchtigt in der Hemmung der IRF3-oder ATF-2/c-Jun Aktivierung. Die Infektion mit der Mutante führte jedoch zu einer verringerten IkBa-Proteinmenge und einem veränderten Profil von NF-kappaB p65 unter Bedingungen inhibierter Proteinsynthese. Diese Befunde weisen auf eine Rolle von M43 in der Feinregulation der NF-kappaB Signalwege hin. Darüber hinaus wurde durch die Generation einer M43-HA exprimierenden Mutante nachgewiesen, dass zwei verschiedene M43-Proteine exprimiert werden. Unter Verwendung dieser Mutante konnte die Interaktion von pM43 mit dem NF- kappaB Inhibitor IkBa gezeigt werden. Dies unterstützt die Schlussfolgerung, dass M43 an der NF-kappaB-Feinregulation partizipiert.

To investigate the interaction between mouse cytomegalovirus (MCMV) and the type I interferon (IFN) system IFNbeta and IFNalpha4 gene transcription and activation of related transcription factors in MCMV-infected fibroblasts was monitored. mRNA analysis demonstrated sustained MCMV inhibition of IFN gene expression after an initial phase of induction. The induction of IFN transcription was due to the activation of the components of the IFNbeta enhanceosome, i.e. IRF3, NF-kappaB and ATF-2/c-Jun. These transcription factors became activated upon MCMV infection in a sequential order, but their activation lasted only transient. As a consequence, IFNalpha/beta gene expression became undetectable 6 hours post infection. The underlying mechanism is based on an active inhibition by MCMV since IFN restimulation by further external stimuli (e.g. Sendai virus infection) was also abolished. This inhibition required viral gene expression and was not observed in cells infected with UV-inactivated MCMV virions. By using an MCMV mutant lacking the gene encoding for the Jak/STAT-inhibitor M27 it was shown that the initial phase of IFNbeta induction and the subsequent inhibition is independent from the positive feedback loop. These findings indicate that MCMV-mediated downregulation of type I IFN transcription in fibroblasts relies on a large arsenal of inhibitory mechanisms targeting each pathway contributing to the multiprotein enhanceosome complex. Systematic mutational analysis of the MCMV genome and phenotypic screening of virus mutants led to the identification of the first MCMV mutant defective in inhibition of IFNbeta transcription. DeltaM43-MCMV was selectively impaired in downregulating IFNbeta gene expression whereas inhibition of IFNalpha4 was not affected. To gain insight into the underlying mechanism the activation of the transcription factors forming the IFNbeta enhanceosome was analyzed. DeltaM43-MCMV was not impaired in disrupting IRF3 or ATF-2/c-Jun activation, but exhibited a decreased IkBa level and an altered pattern of NF-kappaB p65 under conditions of inhibited protein synthesis, pointing to a role of M43 in the finetuning of NF-kappaB mediated signal transduction. Furthermore, the generation of an MCMV mutant expression M43-HA revealed that two different M43 gene products are expressed. Using this mutant the interaction of pM43 with the NF-kappaB inhibitory protein IkBa was detected, supporting the conclusion that M43 partcipates in NF-kappaB fineregulation.