Activation of the Mcm2-7 helicase function by ancillary replication factors GINS and Cdc45: The switch to S phase

Abstract

The association of two auxiliary factors, Cdc45 and GINS, into the CMG (Cdc45/Mcm2 7/GINS) complex activates the pre-assembled Mcm2 7 hexameric helicase in eukaryotes and leads in the cell cycle to the switch into S phase. Protein-protein interaction studies in Psf1, a subunit of the GINS tetramer, identified four critical amino acids, which are essential for assembling the complex and, thus, for activation of the helicase. Cdc45 and GINS proteins remain part of the CMG complex as the replication fork progresses along DNA; however, their direct role remains elusive. A scope of the work presented here is to investigate the role of the allosteric factor Cdc45 during translocation. Surprisingly, Cdc45 directly contacts the leading strand in the absence of nucleotide and displays no interaction with the lagging strand as was earlier hypothesized. Residues in Cdc45 responsible for DNA binding were identified and it was found that mutation of these residues diminished helicase activity as well as processivity of the CMG complex, demonstrating for the first time a direct effect of residues distal to the Mcm2-7 helicase motor on the processivity of the entire CMG complex. All of the eukaryotic Mcm2-7 subunits belong to the AAA+ super-family of ATPases and the ring contains six active site pairs each between two adjacent subunits that bind and hydrolyze ATP. Elimination of the conserved ATP-hydrolysis arginine finger motifs demonstrate a functional asymmetry within the Mcm2-7 ring of the CMG complex. The nucleotide dependence for DNA binding of CMG, and significant crippling of DNA binding upon elimination of the most important active site pairs suggest a direct correlation between defects in ATPase activity and DNA binding by individual Mcm2-7 subunits. A detailed biochemical dissection of CMG affinities for the leading and lagging strands separately also demonstrates the importance of all six Mcm2-7 subunits for the subsequent unwinding mechanism. Three candidate β hairpin motifs of each Mcm2-7 subunit located in the central channel are implicated in DNA binding, and mutational analysis was performed for different critical residues in these hairpins. Side-by-side mutational comparison of isolated Mcm2-7 complexes to CMG helped understand differences and similarities between the inactive and active form of the helicase. Multiple interaction regions of the DmMcm2-7 proteins with the leading strand in the central channel were identified. While the N-terminal β-hairpins (NT-hp) in several Mcm2-7 subunits is crucial for DNA binding in both the free Mcm2-7 and in the CMG complex, the Pre-Sensor1 β-hairpins (PS1-hp) of other subunits are only used for DNA binding in the context of CMG. In contrast to NT-hp, primarily important for DNA binding, PS1 hp contribute directly to the translocation mechanism. The demonstrated unequal contributions with a varying degree of importance of the six Mcm2-7 subunits in the binding and translocation of the leading strand suggest a specific order of activity around the ring, that is in agreement with a model, in which there is a sequential order of events around the Mcm2-7 ring during strand separation with a specific start site for the ‘power stroke’. Furthermore, data show that the lagging strand also binds a subset of Mcm2-7 subunits. Mutations on the external surface of the Mcm2-7 weaken CMG’s affinity for this strand and decrease the helicase activity, suggesting a wrapping of the lagging strand around the external surface during strand separation.

Die Assoziation der beiden Hilfsfaktoren, Cdc45 und GINS, in den CMG (Cdc45/Mcm2 7/GINS) Komplex aktiviert die als Hexamer vormontierte Mcm2-7 Helikase in Eukaryonten und führt im Zellzyklus zum Übergang in die S-Phase. Protein-Protein-Interaktionsstudien identifizierten in Psf1, einer Untereinheit des GINS Tetramers, vier Aminosäuren, die für den Aufbau des Komplexes und damit für die Aktivierung der Helikase kritisch sind. Beide bleiben Bestandteil des CMG Komplexes, und ein Schwerpunkt der hier vorgestellten Arbeit ist es, die Rolle des allosterischen Faktors Cdc45 während der Translokation zu untersuchen. Cdc45 weist unerwartet einen direkten Kontakt zum Leitstrang in Abwesenheit von Nukleotid und keine Interaktion mit dem Folgestrang. Aminosäuren in Cdc45, die für das Binden von DNA verantwortlich sind, wurden identifiziert und ihre Mutation reduziert deutlich die Helikaseaktivität sowie Prozessivität des Enzyms. Erstmals wird hiermit eine direkte Wirkung von Proteinregionen distal des Mcm2-7 Motors auf den gesamten CMG Komplex gezeigt. Alle eukaryontischen Mcm2-7 Untereinheiten gehören zur AAA+ Familie von ATPasen und der Mcm2-7 Ring enthält sechs aktive Zentren jeweils zwischen zwei benachbarten Untereinheiten, die ATP binden und hydrolysieren. Eliminierung der ‚Arginin-Finger’ Motife, die für die ATP Hydrolyse verantwortlich sind, zeigen eine funktionelle Asymmetrie innerhalb des CMG-Komplexes auf. Die Tatsache, dass die Interaktion von CMG zur DNA eine Nukleotidabhängigkeit aufweist, und dass die Mutationen der wichtigsten aktiven Zentren das Binden von DNA auflösen, deutet auf eine direkte Korrelation zwischen Defekten in ATP-Hydrolyse und Interaktion von einzelnen Mcm2-7 Untereinheiten zur DNA. Eine detaillierte biochemische Untersuchung der Affinitäten von CMG zum Leit-und Folgestrang zeigt die Bedeutung aller sechs Mcm2-7 Untereinheiten bezüglich der Strangseparation auf. Drei β Haarnadelmotive jeder Mcm2-7 Untereinheit gelten als Kandidaten für das Binden von DNA, und eine Mutationsanalyse von kritischen Aminosäuren in diesen wurde durchgeführt. Ein paralleler Vergleich der isolierten Mcm2-7 und CMG Komplexe hat geholfen zu verstehen, welche Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen der inaktiven und aktiven Form der Helikase bestehen. Mehrfache Wechselwirkungen der DmMcm2-7 Proteine zu dem Leitstrang wurden innerhalb des zentralen Kanals identifiziert. Während die N-terminalen β-Haarnadeln (NT-hp) weniger Mcm2-7 Untereinheiten von entscheidender Bedeutung für die DNA- Interaktion im isolierten Mcm2-7 sowie im CMG Komplex sind, sind die ‚Pre- Sensor1’ β-Haarnadeln (PS1-hp) von anderen Mcm2-7 Untereinheiten nur für das Binden innerhalb des CMG-Komplexes wichtig. Im Gegensatz zu NT-hp sind die PS1-hp direkt für den Translokationsmechanismus verantwortlich. Die demonstrierten ungleichen Beiträge der Mcm2-7 Proteine deuten auf eine spezifische Reihenfolge der Aktivitäten im Ring, die im Einvernehmen mit einem Modell sind, welches eine sequentielle Abfolge mit einem bestimmten Startpunkt während der Strangtrennung vorsieht. Darüber hinaus zeigen die Daten, dass der Folgestrang ebenfalls Mcm2-7 Proteine bindet. Mutationen auf der äußeren Oberfläche des CMG Komplexes schwächen die Affinität zum Folgestrang und führen zur Verringerung der Helikaseaktivität, was darauf hindeutet, dass während der Translokation der Folgestrang sich um die äußere Oberfläche des CMG Komplexes umwickelt.