The role of the secreted glycoprotein G (gG) in equine herpesvirus type 1 (EHV-1) immune modulation and virulence

Abstract

Equine herpesvirus type 1 and 4 (EHV-1 and EHV-4) affects horses worldwide. Infection with EHV-4 usually remains restricted to the upper airways, while EHV-1 infection can result in neurological disorders and abortions following lymphocyte-associated viremia. One of the possible mechanisms allowing systemic dissemination of EHV-1 is the documented ability of EHV-1 gG, more specifically its hypervariable region, to interfere with the host’s immune response by binding to chemokines. In this study we tested the hypothesis that gG influences the ability of EHV-1 to cause systemic infection by constructing EHV-1 mutants in which the entire gG or only its hypervariable region upstream of the transmembrane region were exchanged with their EHV-4 counterparts. Based on the neurovirulent strain Ohio 2003 (OH- 03), we constructed four recombinant viruses by en-passant mutagenesis of OH-03 cloned as a bacterial artificial chromosome: A gG deletion mutant (vOH-ΔgG), a mutant in which EHV-4 gG was inserted in lieu of authentic EHV-1 gG (vOH-4gG), a mutant harboring EHV-4 gG with the chemokine-binding region of EHV-1 gG (vOH-4gGhyp1) and a mutant harboring the hypervariable region of EHV-4 gG in the EHV-1 backbone (vOH-hyp4). The mutant viruses were characterized in vitro by plaque size assays as well as single-step-growthkinetics and it could be shown that the various mutations in gG did not influence viral cell-tocell spread or replication in vitro. Next, chemotaxis assays were performed to analyze if the various gGs can interfere with neutrophil migration in vitro. Here, an increased chemotaxis of neutrophils could be observed when supernatants of cells infected with vOH-ΔgG or vOH- 4gG were used. In contrast, re-insertion of the predicted chemokine-binding region of EHV-1 glycoprotein G did not completely restore the ability to inhibit neutrophil migration as well as insertion of the hypervariable region of EHV-4 gG did not lead to complete loss of chemokine-binding function of gG. Finally, the different mutant viruses were tested in an in vivo infection model in BALB/c mice. Flow cytometric analyses were performed to determine the composition of immune cells in bronchoalveolar lavages of intranasally infected mice. The largest influx of neutrophils was noted for mice infected with the vOH-4gG virus, whereas here the gG deletion virus behaved more like the OH-03 virus and resulted in a more pronounced inhibition of chemotaxis in infected mice. Again, the two viruses with the exchanged hypervariable region did not show the expected influence on neutrophil migration to the site of infection, suggesting that it is not the hypervariable region alone that determines the immunmodulatory potential of gG.

Infektionen durch equine Herpesviren vom Typ 1 und Typ 4 (EHV-1 und EHV-4) treten in Pferdepopulationen weltweit auf. Während eine Infektion mit EHV-4 primär auf den oberen Respirationstrakt beschränkt bleibt, kann eine Infektion mit EHV-1 nach einer Lymphozytenassoziierten Virämie zu neurologischen Ausfällen und Aborten führen. Einen möglichen Beitrag zur systemischen Verbreitung von EHV-1 liefert das Glykoprotein G, genauer gesagtdessen hypervariable Region, die an Chemokine bindet und dadurch mit der Immunantwort des Wirtes interagieren kann. In dieser Studie wurde die Hypothese getestet, dass gG einer der bestimmenden Faktoren einer systemischen EHV-1 Infektion ist. Hierzu wurden verschiedene EHV-1-Mutanten konstruiert, in welchen das gesamte gG-Gen oder die hypervariable Region allein, aufwärts von der Transmembranregion gelegen, mit den entsprechenden Sequenzen von EHV-4 substituiert wurden. Basierend auf dem neurovirulenten Stamm Ohio 2003 (OH-03) wurden die folgenden Mutanten generiert: eine gG-Deletionsmutante (vOH-ΔgG), eine Mutante, in welcher das EHV-4 gG an Stelle des EHV-1 gGs inseriert wurde (vOH-4gG), eine Mutante mit der Chemokin-bindenden Region des EHV-1 gG im EHV-4 gG (vOH-4hyp1) sowie eine Mutante, in welcher nur die hypervariable Region des EHV-1 gG durch die variable Region des EHV-4 gGs ersetzt wurde (vOH-1hyp4). Die Virusmutanten wurden durch En passant- Mutagenese in dem als Bacterical Artificial Chromosome (BAC) konstruierten Genom des EHV-1 Stammes OH-03 in Escherichia coli generiert. Nach Virus-Rekonstitution wurden die Virusmutanten durch Analyse der Plaquegrößen und Ein-Schritt-Wachstums- Kinetiken in vitro charakterisiert. Hier konnte gezeigt werden, dass sowohl der Austausch des gG zwischen EHV-1 und EHV-4 sowie die verschiedenen Mutationen keine Auswirkung auf die Zell-zu-Zell-Ausbreitung sowie die Vermehrung des Virus haben. Im Anschluss daran wurden Chemotaxis-Assays durchgeführt, um zu eruieren, ob die diversen gGs in der Lage sind, die Migration von neutrophilen Granulozyten in vitro zu beeinflussen. Bei diesen Experimenten konnte beobachtet werden, dass die gG-Deletionsmutante sowie die das EHV-4 gG enthaltende Mutante den Flux von Neutrophilen nicht zu beeinflussen vermochten. Allerdings wurde auch durch die Restaurierung der vorhergesagten Chemokinbindenden Region des EHV-1 gG die Fähigkeit zur Hemmung der Migration von Neutrophilen nicht komplett wiederhergestellt. Ebenso ging die Fähigkeit zur Hemmung auch bei Insertion der hypervariablen Region des EHV-4 gG nicht gänzlich verloren. Im Anschluss an diese Experimente wurden die verschiedenen Mutanten in einem Infektions-Modell in BALB/c Mäusen in vivo getestet. Durchflusszytometrische Analysen wurden ausgeführt, um die Zusammensetzung der Immunzellen in der bronchoalveolären Lavage intranasal infizierter Mäuse und eventuell durch die verschiedenen gG-Varianten erzeugte Unterschiede zu bestimmen. Der größte Einstrom von Neutrophilen an den Infektionsort war bei den Mäusen zu verzeichnen, die mit der vOH-4gG-Mutante infiziert waren, wohingegen der Influx von Neutrophilen bei den mit der Deletionsmutante infizierten Mäuse mehr dem Wildtyp glichen. Wie schon bei den Chemotaxis-Assays zu verzeichnen, zeigten auch hier die zwei Mutanten, in welchen nur die hypervariable Region ausgetauscht wurde, um dem EHV-4 gG die Chemokin-bindende Funktion zu verleihen und diese im EHV- 1 gG zu inaktivieren, nicht das erwartete Muster bezüglich des Einflusses der Migration von Neutrophilen. Dies lässt zu der Annahme führen, dass nicht allein die hypervariable Region für das immunmodulatorische Potential des gG verantwortlich ist sondern auch andere Domänen des Proteins an der Ausbildung des Phänotyps beteiligt sind.