Identification of the Novel Inhibitor of Apoptosis Protein ML-IAP And Characterisation of its Role as a Melanoma Rejection Antigen

Abstract

Melanoma is an important general model for cancer immunology since a large body of evidence has accumulated that the human immune system can recognise the tumour. Moreover, many of the recognised melanoma-associated antigens have been identified in the past. The characterisation of antigens that can lead to the rejection of malignant tissue is of great importance for developing new and efficacious forms of therapy.

Vaccination with autologous irradiated GM-CSF-secreting melanoma cells elicits potent, specific and long-lasting anti-tumour immunity through improved tumour antigen presentation by dendritic cells and macrophages. A clinical phase I study in patients with disseminated melanoma induced the infiltration of distant metastases by T and B cells, which resulted in tumour destruction. While prior to treatment surgically excised metastases showed no infiltrating lymphocytes, CD4+ and CD8+ T cells as well as B220+ B cells and IgG-secreting plasma cells were detected by immunohistochemistry in 11 out of 16 patients examined. The infiltrates were associated with substantial tumour necrosis (at least 80%), fibrosis and oedema. None of the patients displayed signs of autoimmunity. To delineate the antigenic targets of this effective immune response, we analysed a melanoma-based expression library with postvaccination serum from a long-term responding patient. The screening identified the at this time unknown melanoma inhibitor of apoptosis protein (ML-IAP) as a target of high-titre IgG antibodies. The caspase inhibitor ML-IAP protects cells from a wide variety of apoptotic stimuli and is overexpressed in the majority of melanomas. This is of importance since melanoma is predominantly resistant to radio- and chemotherapy. Although antibodies were present in prevaccination serum, treatment increased antibody titre and led to isotope switching to IgG4. Moreover, intratumoral CD4+ and CD8+ lymphocytes from inflamed and necrotic metastases recognised ML-IAP in proliferation, tetramer, ELISPOT and cytotoxicity assays. Staining tissue sections of several surgically resected metastases with a ML-IAP-specific monoclonal antibody revealed that ML-IAP was heavily expressed at the beginning of treatment. Progressing disease and lack of lymphocytic infiltrates, however, was associated with the appearance of antigen loss variants.

Preliminary data suggest that ML-IAP is overexpressed in several other types of cancer. Since ML-IAP can serve as a target for the destruction of tumour tissue by the immune system, we are interested in developing ML-IAP-based vaccines. These strategies will have to include additional antigenic components to prevent evasion of the immune system by loss of antigen expression. Moreover, it will be of great interest to study the normal biologic role of ML-IAP in more detail.

Das Melanom ist als Modell für Krebserkrankungen bedeutungsvoll, da zahlreiche Hinweise auf die Immunogenität dieses Tumortyps vorliegen und eine große Zahl Melanomantigene identifiziert wurden. Diese mit Melanomen assoziierten Tumorantigene werden in einem Teil der Patienten vom Immunsystem erkannt. Die Identifizierung von Tumorantigenen, die zur Abstoßung des malignen Gewebes führen können, ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer und effizienter Krebstherapien.

Vakzinierung mit autologen bestrahlten und GM-CSF sezernierenden Melanomzellen ruft wirksame, spezifische und lange währende Antitumorimmunität durch verbesserte Tumorantigenpräsentation von dendritischen Zellen und Makrophagen hervor. Eine klinische Phase I-Studie führte in Patienten mit metastasierendem Melanom im Spätstadium zu Infiltration des Tumorgewebes durch T- und B-Zellen, die Nekrose und Fibrose hervorriefen. Während vor Behandlungsbeginn chirurgisch entfernte Metastasen keinerlei Infiltration durch Lymphozyten aufwiesen, konnten nach Injektion des Vakzins in 11 von 16 untersuchten Patienten CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie B220+ B-Zellen und IgG sezernierende Plasmazellen durch Anfärben von Tumorgewebsschnitten nachgewiesen werden. Die Infiltrate traten zusammen mit weitgehend zerstörtem Tumorgewebe (mindestens 80%), Fibrose und Ödemen auf. Keiner der Patienten zeigte Anzeichen für Autoimmunreaktionen. Um die antigenen Ziele dieser wirkungsvollen Immunantwort zu charakterisieren, analysierten wir eine auf Melanomzellen basierende Expressionsbibliothek mit dem nach Studienbeginn entnommenen Serum einer auf die Therapie ansprechenden Patientin. Unser Screening identifizierte das zu diesem Zeitpunkt noch unbekannte "melanoma inhibitor of apoptosis protein" (ML-IAP) als Ziel von in hoher Konzentration im Patientenserum vorhandenen IgG-Antikörpern. Der von der humoralen Immunantwort der Patientin erkannte Caspase-Inhibitor ML-IAP schützt Zellen vor einer Vielzahl apoptotischer Stimuli und wird in der Mehrzahl von Melanomen überexprimiert. Dies ist deswegen bedeutungsvoll, weil Melanome überwiegend resistent gegenüber Radio- und Chemotherapie sind. Obwohl Antikörper gegen ML-IAP bereits vor Behandlungsbeginn im Serum vorhanden waren, verursachte die Vakzinierung eine Konzentrationserhöhung und "isotype switching" zu IgG4. Ferner erkannten intratumorale CD4+ und CD8+ Lymphozyten aus entzündeten und nekrotischen Metastasen ML-IAP in Proliferations-, Tetramer-, ELISPOT- und Zytotoxizitäts- Assays. Anfärbungen der Gewebeschnitte von verschiedenen, zu unterschiedlichen Zeitpunkten operativ entfernten Metastasen der Patientin mit einem für ML-IAP spezifischen monoklonalen Antikörper zeigten, daß ML-IAP zu Therapiebeginn stark in infiltrierten und nekrotischen Läsionen exprimiert war. Die fortschreitende Krebserkrankung und das Fehlen von lymphozytischen Infiltraten war jedoch mit dem Aufkommen von Krebszellen ohne ML-IAP-Exprimierung assoziiert ("antigen loss").

Vorläufige Daten legen nahe, dass ML-IAP in mehreren Krebsarten überexprimiert und in einer Zahl der Fälle von der humoralen Immunantwort der Patienten erkannt wird. Da ML-IAP als Ziel für die Zerstörung von Tumorgewebe durch das Immunsystem dienen kann, sind wir daran interessiert, auf ML-IAP basierende Vakzinierungsstrategien zu entwickeln. Diese Strategien werden neben ML-IAP weitere Antigenkomponenten enthalten, um ein Unterlaufen der Immunantwort durch Verlust der Antigenexprimierung zu verhindern. Ferner ist es von großem Interesse, mehr über die biologische Normalfunktion von ML-IAP zu erfahren.