Investigation on the interaction of dipeptidyl peptidase IV with the transactivator of transcription protein of Human Immunodeficiency Virus Type-1

Abstract

# Summary

Human-DPPIV is a multifunctional protein which is involved in several biological processes. The role played by DPPIV in HIV-infection and the outbreak of AIDS are poorly studied. Furthermore, the mechanisms and potential ligands involved in the DPPIV–HIV interaction are largely unknown. The HIV1-TAT protein which plays a crucial role for viral replication and transcription was described as a partial inhibitor of DPPIV and suppressor of the DPPIV-dependent activation of T cell growth. Opposed to human-DPPIV protein, the tertiary structure of HIV1-TAT protein which would reveal details about the protein and how to target the protein with drugs has not been elucidated.

In the underlying work the HIV1-TAT protein was functionally expressed and purified from E. coli and Sf9 cells with variable fusion tags. The purified recombinant TAT proteins revealed TAT-specific transactivation activity. The combination of GST and a 6xHis tag influenced the protein stability positively such that the GST-TAT-His protein revealed the highest TAT-specific transactivation activity. Furthermore, it could be demonstrated that purified recombinant TAT, TAT10xHis, His-TAT-His and Sf9-TAT partially inhibit the proteolytic cleavage of GLP1 by human-DPPIV protein. GST-TAT-His and GST-TAT could not inhibit the enzyme activity of DPPIV, which authenticated that the free N-terminus of TAT is essential for its inhibition of DPPIV. The inhibition effect of TAT on DPPIV was weak and became saturated at a concentration of 1 µM TAT: 16 nM DPPIV. A characterization of the recombinant TAT protein by gel-filtration and electron microscopy revealed that TAT protein is intrinsically unstructured, a property which hampered its crystallization.

Investigation on the interaction of HIV1-TAT and human-DPPIV in CHO cells revealed a DPPIV-dependent induction of apoptotic cell death by TAT. This effect of TAT on DPPIV-expressing CHO cells resembles the rapid cell death that leads to the depletion of CD4+ T cells during the acute phase of HIV- infection and implies a possible role of the TAT-DPPIV-association in the depletion of cells during HIV-infection.

Also, HIV1-TAT and human-DPPIV were functionally co-expressed in Sf9 cells by the BAC-TO-BAC® baculovirus system. Compared to DPPIV being expressed alone, TAT/DPPIV co-expressing cells revealed an increase in the overall level of DPPIV expression. Owing to this co-expression, co-association of HIV1-TAT and human-DPPIV protein was detected. Furthermore, a direct binding of the proteins following their co-expression could be demonstrated, which appeared to be possible due to a reduced post-translational modification of the TAT protein. In effect, there was a 78% reduction of serine-phosphorylation of the HIV1-TAT protein as a result of its co-expression with human-DPPIV. It could also be demonstrated with the purified recombinant GST-TAT-His protein which due to the N-terminal GST was unable to inhibit the enzymatic activity of DPPIV, that the inhibition of DPPIV enzyme activity may play a role, but is not a prerequisite for the induction of tyrosine-phosphorylation and hence signalling function of human-DPPIV.

One of the main aims of this work was the characterization of the TAT/DPPIV protein complex. As earlier mentioned the TAT protein is intrinsically unstructured. Moreover, it undergoes post-translational modifications when expressed alone in Sf9 cells, which hindered its direct binding to separately expressed DPPIV protein in vitro. Through co-immunoprecipitation of TAT and DPPIV from TAT/DPPIV co-expressing cells it could be demonstrated that the production and purification of their complex can only be realized following their co-expression. The purification turned out to be quite tedious due to the instability of the TAT protein. Nevertheless, purification of a soluble active TAT/DPPIV protein complex under special care was achieved which could be used for crystallization. Many crystals could be picked after a couple of weeks. However, X-ray analyses of the largest crystals revealed only mass densities of the human-DPPIV protein. The observation that mass densities of natively unfolded proteins remain missing in X-ray analyses of crystals is well documented and at least explains why mass densities of the TAT protein in the complex could not be determined. Taken together, it can be said that the TAT-DPPIV interaction is involved in mediating tyrosine-phosphorylation of DPPIV. Moreover, it plays a role in the initiation of signalling platforms which control TAT post-translational modifications such as serine-phosphorylation and regulate TAT-dependent induction of HIV gene-expression.

In the last part of this work the human-Caveolin-1 protein was successfully expressed in E. coli and purified in its soluble form. Its interaction with human-DPPIV protein could be demonstrated by immunoprecipitation and SPR. The analysis by SPR revealed that the binding of human-DPPIV with Caveolin-1 is weak and requires comparatively high molar ratios of the Caveolin-1 compared to lower amounts of the DPPIV protein.

## Zusammenfassung

DPPIV ist ein multifunktionelles Protein, welches in vielen biologischen Prozessen involviert ist. Welche Rolle DPPIV bei der HIV-Infektion und dem Ausbruch von AIDS spielt, ist bisher jedoch weitestgehend unbekannt. Sowohl der Funktionsmechanismus als auch potentielle Liganden, die an der DPPIV-HIV-Interaktion beteiligt sein könnten, wurden bisher nicht beschrieben. Das HIV1-TAT-Protein, welches eine zentrale Rolle bei der viralen Replikation und Transkription spielt, wurde als Inhibitor der DPPIV-Enzymaktivität beschrieben. Demnach führt das HIV1-TAT- Protein zur Suppression der DPPIV-abhängigen Aktivierung der T-Zell- Proliferation. Im Gegensatz zum DPPIV-Protein, wurde die tertiäre Struktur des HIV1-TAT-Proteins, die zur Klärung näherer Einzelheiten über die Wechselwirkung des Proteins mit anderen Partnern bzw. Medikamenten beitragen würde, bislang nicht aufgeklärt.

In der vorliegenden Arbeit wurde das HIV1-TAT-Protein mit unterschiedlichen Fusions-Tags funktionell in E. coli und Sf9-Zellen exprimiert und aufgereinigt. Die aufgereinigten Proteinen zeigten die TAT-spezifische Transaktivierungsaktivität. Das rekombinante TAT-Protein mit einem N-terminalen GST- und C-terminalen His-Tag zeigte die höchste Stabilität und Transaktivierungsaktivität. Weiterhin konnte mit TAT10xHis, TAT, His-TAT-His und Sf9-TAT eine partielle Hemmung der proteolytischen Spaltung von GLP1 durch DPPIV nachgewiesen werden, was wiederum die Annahme bestätigt, dass der freie N-Terminus von TAT für die Inhibition essentiell ist. Die Hemmung von DPPIV durch TAT war schwach und erreichte bei einer Konzentration von 1 µM TAT: 16 nM DPPIV die Sättigung. Die Charakterisierung der rekombinanten TAT-Proteine mittels Gelfiltration und Elektronenmikroskopie stellte das TAT-Protein als intrinsisch unstrukturiertes Protein dar, was die Kristallisation des Proteins verhinderte.

Untersuchungen zur Interaktion des HIV1-TAT-Proteins mit dem humanen-DPPIV- Proteins in CHO-Zellen zeigten eine DPPIV-abhängige Induktion der Apoptose durch TAT. Dieser Prozess ähnelt dem raschen Zelltod, der bei der Depletion der CD4+-T-Zellen in HIV-infizierten Patienten auftritt und impliziert eine Beteiligung der TAT-DPPIV-Wechselwirkung bei der Depletion von T-Zellen in HIV-infizierten Patienten. Desweiteren, wurden das HIV1-TAT- und das humane-DPPIV-Protein in Sf9 Zellen über das BAC-TO-BAC® Baculovirus System co-exprimiert. Im Vergleich zur DPPIV, das allein in Sf9 Zellen exprimiert wurde, konnte bei TAT/DPPIV-co- exprimierenden Zellen eine Erhöhung der Gesamt-DPPIV-Expression beobachtet werden. Aufgrund dieser Co-Expression konnte die Co-Assoziation und direkte Bindung des HIV1-TAT mit dem DPPIV-Protein nachgewiesen werden. Die Bindung von TAT und DPPIV in TAT/DPPIV-co-exprimierenden Sf9-Zellen scheint durch eine Verminderung der post-translationalen Modifikationen des TAT-Proteins möglich zu sein. Es wurde eine 78%ige Verminderung in der Serin-Phosphorylierung von TAT in TAT/DPPIV-co-exprimierende Sf9-Zellen festgestellt. Mit dem GST-TAT-His Protein, das Aufgrund des N-terminalen GST-Tag nicht in der Lage war die enzymatische Aktivität von DPPIV zu hemmen, konnte eine TAT-abhängige Induktion der Tyrosin-Phosphorylierung von DPPIV gezeigt werden. Dies führte zu der Annahme, dass die Inhibition von DPPIV-Enzymaktivität keine Vorraussetzung für die Induktion der Tyrosin-Phosphorylierung und somit das Einschalten von Signalkaskaden durch phosphoryliertes DPPIV darstellt. Einer der Hauptziele dieser Arbeit war die Charakterisierung des TAT/DPPIV- Protein-Komplexes. Wie bereits erwähnt konnte im Laufe dieser Arbeit festgestellt werden, dass das TAT-Protein intrinsisch unstrukturiert ist. Desweiteren haben post-translationale Modifikationen des in Abwesenheit von DPPIV exprimierte TAT-Proteins zur Folge, dass die Bindung mit getrennt exprimierten DPPIV in vitro deutlich schlechter ist. In Ko- Immunpräzipitations-Versuchen konnte gezeigt werden, dass die Herstellung und Aufreinigung eines Komplexes beider Proteine nur nach deren Ko-Expression möglich ist. Jedoch stellte sich bei der Aufreinigung des TAT/DPPIV-Protein- Komplexes heraus, dass das TAT-Protein sehr instabil war. Dennoch konnte unter besonderen Vorsichtsmassnahmen ein aktiver TAT/DPPIV-Protein-Komplex aufgereinigt und für die Kristallisation eingesetzt werden. Mehrere Kristalle konnten geerntet werden. Die Röntgenstrukturanalyse der größten Kristalle zeigte allerdings keine Massendichte des TAT-Proteins, was zumindest auf seine Eigenschaft als intrinsisch unstrukturiertes Proteins zurückzuführen ist. Es konnte nur die Massendichte des DPPIV-Proteins gemessen werden. Zusammenfassend lässt die vorliegende Arbeit schlussfolgern, dass die TAT- DPPIV-Wechselwirkung bei der Vermittlung der Tyrosin-Phosphorylierung von DPPIV eine Rolle spielt. Darüber hinaus werden Signalkaskaden initiiert, die gezielt die post-translationalen Modifikation wie beispielsweise die Serin- Phosphorylierung von TAT-Proteinen kontrollieren und somit die TAT-abhängige Induktion der HIV-Genexpression regulieren können.

Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das humane-Caveolin-1-Protein in E. coli exprimiert und in seiner löslichen Form aufgereinigt. Die Interaktion des humanen-Caveolin-1-Proteins mit dem humanen-DPPIV-Protein wurde mittels Immunpräzipitation und SPR bestätigt. Die Bindungsanalyse mittels SPR liess darauf schliessen, dass die Binding von DPPIV mit Caveolin-1 relativ schwach ist und eine höhe Menge an Caveolin-1 gegenüber einer geringeren Menge an DPPIV benötigt wird.