Cryoprotective activity of four dehydrins expressed in E.coli and their influence on thylakoid membrane permeability in comparison to cryoprotectin

Abstract

In this work the cryoprotective activity of four dehydrins expressed in E.coli were analyzed. These proteins play an important protective role during cold and water-deficit stress in plants. We proved that three of four analyzed recombinant dehydrin proteins (LTI29, COR47 and ERD14) are cryoprotectively active in a "freezing test". For the dehydrin RAB 18 in this test a low cryoprotective activity has been shown. By using of Boyle van't Hoff analyse the thylakoid membrane permeability has been examined in the presence of dehydrin proteins. It has been shown that the cryoprotective dehydrins increase the membrane permeability in the freeze-thaw cycle. This might be a possible mechanism by which the dehydrin proteins cryoprotectively affect the cell membranes. Also, the influence of the LTI 29 dehydrin on the thylakoid membrane's permeability was further analyzed in the LSS (light scattering system) system. The results obtained coincide with the results from the Boyle van't Hoff analyses, what has brought us to füurther understanding that cryoprotective dehydrins increase the membrane's permeability. Difference in activity between dehydrin LITI29 and CPP was noticed when these two proteins were added separately in the thylakoid suspension during the long incubation time. According to these analyses dehydrins protect thylakoid membranes during long period of time, while CPP doesn't. Similarly, the difference in thylakoid's sedimentation was noticed in the presence of CPP and LTI29 separately, when these proteins are incubated on 0 C during a longer period of time. In the presence of added LTI29 the thylakoid sedimentation is hindered, contrary to CPP, what leads to the conclusion about the different mechanism of activity of these two proteins. The presence of Ca2+ and Mn2+ ions has an influence on the apparent LSS signal. These ions increase the LSS signal in the presence of CPP, while in the presence of LTI29, LSS signal remains unchanged. This further supports the conclusion that the mechanism of the activity of CPP and the dehydrins is different. According to our Western blot analyses the dehydrin LTI29 is bound to the thylakoid membrane, while RAB 18 isn't. This points out that the binding ability of dehydrins could be included in complex mechanism of cryoprotective activity of dehydrins.

In dieser Arbeit wurde die Frostschutzaktivitaet von vier in E.coli exprimierten Dehydrinen, analysiert. Diese Proteine spielen eine wichtige Schutzrolle waehrend Kaelte- und Trockenstress in Pflanzen. Wir haben bewiesen, dass drei von vier analysierten rekombinanten Dehydrinen (LTI29, COR47 und ERD14) im "Frostschutztest" Frostschutzaktivitaet haben. Füuer das Dehydrin RAB 18 ist in diesem Test eine niedrige Frostschutzaktivitaet gezeigt worden. Die Permeabilitaet der Thylakoidenmembran in Gegenwart der Dehydrine ist mittels Boyle van't Hoff Analyse geprüueft worden. Es ist gezeigt worden, dass die frostschutzaktiven Dehydrine die Membranpermeabilitaet im Gefrier- Tau-Cyclus erhoeöhen. Es handelt sich möoeglicherweise um einen Mechanismus, bei dem die Dehydrine frostschueützende Wirkung auf die Zellmembran haben. Weiterhin wurde auch der Einfluss des LTI 29-Dehydrins auf die Permeabilitaet der Thylakoidmembranen im LSS-System (light scattering system) analysiert. Bei den Resultaten erhielten wir eine Uebereinstimmung mit den Ergebnissen der Boyle van`t Hoff- Analyse, was uns bestaetigte, dass die kryoprotektiven Dehydrine die Membranpermeabilitaet erhöoehen. Bei langen Inkubationszeiten der Thylakoidsuspensionen mit LTI 29 oder CPP zeigten sich Aktivitaetsunterschiede zwischen diesen beiden Proteinen. Entsprechend dieser Analyse schüuetzen Dehydrine Thylakoidmembranen ueüber einen langen Zeitraum im Gegensatz zu CPP. Ein Unterschied wurde auch bei der Thylakoidsedimentation in Gegenwart von CPP und LTI 29, jedesmal separat zugegeben, festgestellt als diese Proteine bei 0 C waehrend einer langen Zeitspanne inkubiert wurden. In Gegenwart von LTI 29 wurde die Thylakoidsedimentation verhindert, im Gegensatz zu CPP, was uns zur Annahme von unterschiedlichen Mechanismen der Aktivitaet fueührt. Die Gegenwart von Ca2+ und Mn2+ Ionen hat Einfluss auf das apparente LSS-Signal. Diese Ionen erhoeöhen das LSS-Signal in Gegenwart von CPP, waehrend in Gegenwart von LTI 29 das LSS Signal unveraendert bleibt. Dies unterstüuetzt weiterhin den Schluss, dass der Mechanismus der Frostschutz- Aktivitaet bei CPP und den Dehydrinen, unterschiedlich ist. Entsprechend unserer Westernblotanalysen ist das Dehydrin LTI 29 an die Thylakoidmembran gebunden, waehrend dies bei RAB 18 nicht der Fall ist. Das bedeutet, dass die Bindungsfaehigkeit der Dehydrine in den komplexen Mechanismus der Frostschutzaktivitaet der Dehydrine eine Rolle spielen koennte.