Evaluation of factors potentially influencing hyperketonemia testing in dairy cows

Abstract

Hyperketonemia is a common condition in early lactating dairy cows. Usually induced by a maladaptation to the negative energy balance affecting most dairy cows during early lactation, it increases the risk for the development of subsequent diseases. Furthermore, a negative impact on reproduction parameters is proven. As most cows suffering from hyperketonemia do not show clinical signs of ketosis, the diagnosis depends on the measurement of ketone bodies in blood, milk or urine. Laboratory-based measurement of increased blood concentrations of ß-hydroxybutyrate (BHBA) is the gold standard for the diagnosis of hyperketonemia, using cut-points of 1.2 mmol/L or 1.4 mmol/L. In addition, a range of semiquantitative or quantitative cow-side hyperketonemia tests is available. Currently, electronic handheld blood BHBA meters are frequently used in the diagnostic of hyperketonemia. Strategic hyperketonemia screening protocols have been recommended, addressing 2 main objectives: first to detect and subsequently treat affected cows and second to monitor and evaluate the success of early lactation feeding and management procedures. The overall objective of this thesis was to evaluate factors potentially influencing the diagnostic of hyperketonemia in dairy cows. The aim of the first study was to investigate the effect of sampling time in the course of a day on blood BHBA concentrations in continuously fed dairy cows. Furthermore, test characteristics of single and repeated BHBA measurements during the day to diagnose subclinical ketosis were determined for 2 frequently used BHBA cut-points (1.2 mmol/L and 1.4 mmol/L). A total of 128 cows (8 to 28 days in milk (DIM) fed with a total mixed ration (TMR) 10 times daily were preselected by blood BHBA concentration, measured with an electronic handheld meter. Cows with BHBA concentrations ≥ 0.8 mmol/L at the initial measurement were enrolled in the trial (n = 92). Subsequent measurements were repeated in intervals of 3 h for a total of 8 measurements during 24 h. The analysis conducted indicated that sampling time did not affect BHBA concentration (P = 0.23). To evaluate test characteristics of single and repeated BHBA measurements, the average daily BHBA concentration, averaged from the 8 measurements, was used as gold standard. A single BHBA measurement at a random time of the day had a sensitivity of 0.90 and a specificity of 0.88, using a BHBA concentration of 1.2 mmol/L as cut-point. Using 1.4 mmol/L as cut-point, sensitivity and specificity were 0.89 and 0.90, respectively. Repeating measurements after different time intervals in cases of marginal BHBA concentrations (1.0 mmol/L to 1.6 mmol/L) and using the averaged BHBA concentration from both measurements to diagnose hyperketonemia improved test characteristics only slightly. In conclusion, blood samples for measurement of BHBA in continuously TMR fed dairy cows to can be drawn at any time of the day. A single measurement provides very good test characteristics, which can be enhanced slightly by repeating measurements in cows with marginal BHBA concentrations. The second study was conducted to compare BHBA concentrations in blood samples drawn from 3 in daily practice frequently used sampling locations (A./V. coccygealis, V. jugularis, V. epigastrica cranialis superficialis). Blood samples of 116 early lactating dairy cows were drawn from the 3 sampling locations and tested for BHBA using an electronic handheld meter. Concentrations of BHBA differed between the sampling locations (P = 0.03). Mean BHBA concentration in samples drawn from the V. epigastrica cranialis superficialis was 0.3 mmol/L lower compared with samples drawn from the V. jugularis and 0.4 mmol/L lower compared with samples drawn from the A./V. coccygealis. Mean BHBA concentration did not differ significantly between samples drawn from the V. jugularis and samples drawn from the A./V. coccygealis (P = 0.82). In conclusion, blood samples for measurement of BHBA in lactating dairy cows should be drawn from the V. jugularis or A./V. coccygealis, whereas samples drawn from the V. epigastrica cranialis superficialis.contain significantly lower concentrations of BHBA. The objective of the third study was to describe factors concerning the timing and setting of hyperketonemia screening protocols during early lactation. A total of 252 cows from 3 dairy farms were tested twice weekly during the first 42 DIM using an electronic handheld BHBA meter. The resulting 12 test results per cow therefore corresponded to lactation weeks 0.5 to 6.0. The time of onset of hyperketonemia, the number of positive hyperketonemia test results, and the duration of the longest hyperketonemic period during the first 42 DIM were investigated. Furthermore, test characteristics of single and repeated BHBA measurements during this period to diagnose hyperketonemia were evaluated to simulate different hyperketonemia screening protocols. In detail, test characteristics of 4 different testing scenarios (testing all cows 1, 2, 3, or 6 times during the first 42 DIM) were calculated for 2 different gold standard definitions (BHBA ≥ 1.2 mmol/L at least once or BHBA ≥ 1.2 mmol/L at least twice during the first 42 DIM). Mean prevalence of hyperketonemia was 11.8% and ranged between 9.6% in lactation weeks 0.5 and 2.0 and 14.6% in lactation week 5.5. A total of 134 cows (53.2%) had at least 1 positive hyperketonemia test result during the observation period. Of these cows, 47% had the first positive hyperketonemia test later than 14 DIM. The median first positive hyperketonemia test result occurred in lactation week 2.0 (interquartile range (IQR) 1.0 to 3.5). Of all cows with hyperketonemia, 46.3% had only 1 positive test result. Median frequency of positive BHBA test results in cows affected by hyperketonemia was 2 (IQR 1 to 3). The longest hyperketonemic period in affected cows lasted in median 1 examination interval (3-4 days; IQR 1-2 examination intervals). Test characteristics of the 4 testing scenarios varied depending on the test frequency and the gold standard considered. A single BHBA measurement during the whole 42 day period achieved a sensitivity of 21% and a specificity of 100% considering a minimum of 1 positive hyperketonemia test result during the 42 day period as gold standard. A testing scenario including weekly measurements of BHBA had a sensitivity of 72% and a specificity of 100% considering the same gold standard. Increasing the gold standard to a minimum of 2 positive hyperketonemia test results, i.e. in cases of sustained or repeated hyperketonemia, sensitivity and specificity were 33% and 97% for a single BHBA measurement during the first 42 DIM and 91% and 83% for a testing scenario including weekly measurements, respectively. These data, in conclusion, show that hyperketonemia affects cows at least over the first 42 DIM. Screening protocols therefore should consider a longer period than the frequently mentioned first 2 weeks of lactation. A moderately laborious screening protocol including a biweekly testing scheme during the first 42 DIM achieves a sensitivity of 69% and a specificity of 91% considering cases of sustained or repeated hyperketonemia. Further research is needed to investigate the effects of an isolated positive BHBA tests during the whole observation period on disease risk, milk yield and reproductive performance. The objective of the fourth study was to evaluate test characteristics of a new commercially available electronic handheld BHBA meter to diagnose hyperketonemia in dairy cows. Blood BHBA in samples from 155 lactating dairy cows from 3 farms was measured using the handheld device (NovaVet, Nova Biomedical, Waltham, MA, USA). Subsequently, blood was centrifuged and serum analyzed by a commercial laboratory. Concentrations determined by the device and the laboratory were compared. The methods were highly correlated (rs = 0.87; P < 0.05). A difference (median 0.0 mmol/L; IQR -0.1 to 0.2 mmol/L; P < 0.05) was observed between BHBA concentrations measured by the handheld device (median 1.0 mmol/L; IQR 0.7 to 1.3 mmol/L) and the laboratory (median 0.9 mmol/L; IQR 0.7 to 1.1 mmol/L). Sensitivity and specificity of the handheld device were 97% and 82%, respectively, using a cut-point of 1.2 mmol/L to diagnose cows as hyperketonemic. Using a gold standard cut-point of 1.4 mmol/L, the receiver operating characteristic analysis determined an adjusted cut-point of 1.3 mmol/L for the handheld device. Sensitivity and specificity were 96% and 85%, respectively. In conclusion, the handheld device can be recommended for the diagnostic of hyperketonemia in dairy cows. However, due to the specificities of 82% and 85%, respectively, a certain number of false positive results must be considered.

Ein Großteil der Milchkühe weist während der Frühlaktation erhöhte Ketonkörperkonzentrationen im Blut auf. Diese werden in der Regel durch eine Maladaptation des Metabolismus an die in dieser Zeit sehr häufig auftretende negative Energiebilanz verursacht. Gesicherte Folgen der Hyperketonämie sind eine erhöhte Wahrscheinlichkeit der Kühe, an assoziierten Erkrankungen wie Labmagenverlagerung oder Metritis zu erkranken, sowie eine verminderte Reproduktionsleistung. Da die Hyperketonämie häufig ohne klinische Anzeichen verläuft, beschränkt sich die Diagnostik auf die Messung der 3 Ketonkörper Aceton, Acetoacetat und ß-Hydroxybutyrat (BHB) in Blut, Milch oder Urin. Die laborgestützte Messung von BHB im Blut oder Serum ist als Goldstandard zur Diagnose der Hyperketonämie etabliert. Häufig verwendete Grenzwerte sind 1,2 mmol/L und 1,4 mmol/L. Zusätzlich ist eine Anzahl semiquantitativer Testverfahren auf dem Markt, bei denen der Farbumschlag eines pulverförmigen, auf Teststreifen aufgebrachten oder in Tablettenform gepressten Reagens das Vorhandensein erhöhter Ketonkörperkonzentrationen in Milch oder Urin anzeigt. Seit einiger Zeit existieren zusätzlich elektronische Handmessgeräte zur Messung von BHB im Vollblut. Zum Auffinden an Hyperketonämie erkrankter Tiere sowie zur Überwachung und Erfolgskontrolle von Management- und Fütterungsprotokollen wird der Einsatz strategischer Screeningprogramme empfohlen. Ziel dieser Doktorarbeit war die Evaluation möglicher die Diagnostik der Hyperketonämie beeinflussender Faktoren. Zielsetzung der ersten Studie war die Untersuchung des Einflusses des Probenentnahmezeitpunktes im Tagesverlauf auf BHB-Blutkonzentrationen bei kontinuierlich gefütterten Kühen. Weiterhin wurden Testcharakteristika einzelner sowie im Tagesverlauf wiederholter BHB-Messungen zur Diagnostik der Hyperketonämie für 2 häufig verwendete Grenzwerte (1,2 mmol/L und 1,4 mmol/L) bestimmt. Einer Gesamtanzahl von 128 frühlaktierenden Kühen (Laktationstag 8 bis 28), denen mittels Hochband zehnmal täglich eine Totale Mischration (TMR) vorgelegt wurde, wurden Blutproben entnommen und mittels eines elektronischen Handmessgerätes auf die Höhe der BHB-Konzentration untersucht. Kühe mit BHB-Konzentrationen ≥ 0,8 mmol/L wurden in die Studie aufgenommen (n = 92). Im weiteren Verlauf erfolgten wiederholte Blutentnahmen in Intervallen von 3 Stunden über eine Gesamtdauer von 24 Stunden. Die nachfolgende Auswertung ergab, dass der Zeitpunkt der Probenentnahme im Tagesverlauf bei kontinuierlich gefütterten Kühen keinen Effekt auf die Höhe der gemessenen BHB-Konzentration hat (P = 0,23). Zur Evaluation der Testcharakteristika einer einzelnen sowie wiederholter BHB-Messungen im Tagesverlauf wurde für jede Kuh das arithmetische Mittel, gebildet aus den 8 Messwerten, als Goldstandard zur Diagnose einer Hyperketonämie verwendet. Eine einzelne BHB-Messung zu einem zufälligen Tageszeitpunkt wies bei einem Grenzwert von 1,2 mmol/L eine Sensitivität von 0,90 und eine Spezifität von 0,88 auf. Eine Erhöhung des Grenzwertes auf 1,4 mmol/L ergab eine Sensitivität von 0,89 und eine Spezifität von 0,90. Die Wiederholung der Messung nach verschiedenen Zeitspannen und nachfolgende Verwendung des Durchschnittswertes beider Messungen in Fällen, bei denen eine grenzwertnahe BHB-Konzentration (1,0 mmol/L bis 1,6 mmol/L) gemessen wurde, verbesserte die Testcharakteristika nur geringfügig. Daher ist die Entnahme von Blutproben zur BHB-Messung bei kontinuierlich gefütterten Kühen zu jeder Tageszeit möglich. Eine einmalige Messung zur Diagnostik der Hyperketonämie weist sehr gute Testcharakteristika auf, die durch eine zeitlich verzögerte Wiederholung der Probenentnahme und Messung bei Kühen mit grenzwertnahen BHB-Konzentrationen nur geringfügig verbessert werden kann. Ziel der zweiten Studie war der Vergleich dreier in der Praxis häufig verwendeter Blutentnahmeorte (A./V. coccygealis, V. jugularis und V. epigastrica cranialis superficialis) zur BHB-Messung. Hierzu wurden 116 laktierenden Kühen Blutproben an den 3 Entnahmeorten entnommen und mittels eines elektronischen Handmessgerätes auf die enthaltenen BHB- Konzentrationen hin untersucht. Die gemessenen BHB-Konzentrationen schwankten zwischen den aus den unterschiedlichen Blutgefäßen entnommenen Proben (P = 0,03). Die aus der V. epigastrica cranialis superficialis entnommenen Proben enthielten um 0,3 mmol/L niedrigere mittlere BHB-Konzentrationen als die aus der V. jugularis entnommenen Proben sowie um 0,4 mmol/L niedrigere mittlere BHB-Konzentrationen als die aus der A./V. coccygealis entnommenen Proben. Zwischen den aus der V. jugularis und der A./V. coccygealis entnommenen Proben bestanden keine signifikanten Konzentrationsunterschiede (P = 0,82). Aus diesen Ergebnissen schlussfolgernd sollten Blutproben zur BHB-Messung bei laktierenden Milchkühen aus der V. jugularis oder der A./V. coccygealis entnommen werden. Aus der V. epigastrica cranialis superficialis entnommene Proben weisen signifikant niedrigere BHB-Konzentrationen auf. Das Ziel der dritten Studie war die Beschreibung epidemiologischer Eckdaten der Hyperketonämie während der Frühlaktation sowie die Evaluation verschiedener Protokolle zur Erkennung erkrankter Tiere. Im Einzelnen wurde der Zeitpunkt des Beginns der Hyperketonämie, die Anzahl positiver Testergebnisse sowie die Dauer der längsten hyperketonämischen Phase während der ersten 42 Laktationstage untersucht. Weiterhin wurden Testcharakteristika einzelner und wiederholter BHB-Messungen während dieses Zeitraumes zur Diagnose einer Hyperketonämie evaluiert. Hierzu wurden 4 verschiedene Testscenarien (1, 2, 3 oder 6 BHB-Messungen während der ersten 42 Laktationstage) unter Verwendung zweier verschiedener Goldstandard-Definitionen (G1: mindestens ein BHBWert ≥ 1,2 mmol/L oder G2: mindestens 2 BHB-Werte ≥ 1,2 mmol/L während der ersten 42 Laktationstage) entwickelt. Insgesamt 252 Milchkühe von 3 Betrieben wurden während der ersten 42 Laktationstage zweimal wöchentlich mit Hilfe eines elektronischen BHBMessgerätes untersucht. Die resultierenden 12 Testergebnisse pro Kuh entsprachen somit den Laktationswochen 0,5 bis 6,0. Die Auswertung der Daten ergab eine mittlere Hyperketonämie-Prävalenz von 11,8% mit Werten zwischen 9,6% in den Laktationswochen 0,5 und 2,0 und 14,6% in Laktationswoche 5,5. Insgesamt wiesen 134 Kühe (53,2%) zu mindestens einem Untersuchungszeitpunkt eine Hyperketonämie auf. Bei 47% dieser Kühe trat die Hyperketonämie erst nach dem 14. Laktationstag erstmals auf. Im Median trat das erste positive Testergebnis in Laktationswoche 2.0 auf (Interquartilsabstand (IQR) 1.0 bis 3.5). Von allen an Hyperketonämie erkrankten Tieren wiesen 46.3% nur ein einziges positives Testergebnis während des gesamten Untersuchungszeitraumes auf. Die Häufigkeit positiver Testergebnisse bei erkrankten Tieren lag im Median bei 2 (IQR 1 bis 3). Die längste zusammenhängende hyperketonämische Phase dauerte bei erkrankten Tieren im Median ein Untersuchungsintervall und somit 3 bis 4 Tage an (IQR 1 bis 2 Untersuchungsintervalle). Die Testcharakteristika der 4 untersuchten Testscenarien schwankten abhängig von der Untersuchungsfrequenz und dem verwendeten Goldstandard. Eine einzelne BHB-Messung während des gesamten 42-tägigen Untersuchungszeitraumes erreichte eine Sensitivität von 21% und eine Spezifität von 100% bei Verwendung des Goldstandards G1. Im Gegensatz dazu erreichte ein aus wöchentlichen Messungen bestehendes Testscenario eine Sensitivität von 72% und eine Spezifität von 100% bei Verwendung desselben Goldstandards. Eine Erhöhung des Goldstandards auf eine Mindestanzahl von 2 positiven BHB-Testergebnissen (G2) ergab für eine einzelne BHB-Messung während des gesamten Untersuchungszeitraumes eine Sensitivität von 33% und eine Spezifität von 97%. Wöchentliche BHB-Messungen erreichten hier eine Sensitivität von 91% sowie eine Spezifität von 83%. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass Hyperketonämie bei Milchkühen mindestens während der ersten 42 Laktationstage auftritt. Dies sollte bei der Planung strategischer Untersuchungsprotokolle berücksichtigt werden. Ein aus 3 BHB-Messungen in zweiwöchigen Abständen während der ersten 42 Laktationstage bestehendes Protokoll erzielt eine Sensitivität von 69% und eine Spezifität von 91% unter Verwendung des Goldstandards G2. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um die Effekte einzelner positiver Testergebnisse während des gesamten Untersuchungszeitraumes auf Milch- und Reproduktionsleistung sowie das Risiko der Kühe, assoziierte Erkrankungen zu entwickeln, zu ermitteln. Ziel der vierten Studie war die Evaluation eines zu dem Zeitpunkt neu im Handel befindlichen elektronischen BHB-Handmessgerätes zur Diagnose der Hyperketonämie bei Milchkühen. Hierzu wurden Blutproben von 155 laktierenden Milchkühen mittels des Gerätes (NovaVet, Nova Biomedical, Waltham, MA, USA) auf ihre BHB-Konzentration hin untersucht. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert und die BHB-Konzentrationen der gewonnenen Serumproben in einem kommerziellen Labor gemessen. Die vom Labor ermittelten Werte wurden nachfolgend im Vergleich der beiden Verfahren als Goldstandard eingesetzt. Die vom Gerät und im Labor gemessenen Werte waren hoch korreliert (rs = 0,87; P < 0,05). Zwischen den mit dem Gerät (1,0 mmol/L; IQR 0,7 bis 1,3 mmol/L) und dem Labor (0,9 mmol/L; IQR 0,7 bis 1,1 mmol/L) gemessenen medianen BHB- Konzentrationen wurde eine Differenz von 0,0 mmol/L (IQR -0,1 bis 0,2 mmol/L; P < 0,05) festgestellt. Sensitivität und Spezifität des Gerätes betrugen 97% und 82% bei Verwendung eines Grenzwertes von 1,2 mmol/L. Bei Verwendung einer im Labor gemessenen BHBKonzentration von 1,4 mmol/L als Goldstandard ergab die durchgeführte Receiver-Operating-Characteristic-Analyse die besten Testcharakteristika bei der Verwendung eines optimierten Grenzwertes von 1,3 mmol/L für das Gerät. Sensitivität und Spezifität lagen hierbei bei 96% und 85%. Zusammenfassend kann das Gerät für die Diagnostik der Hyperketonämie beim Milchrind empfohlen werden. Es muss allerdings aufgrund der Spezifität in Höhe von 82% beziehungsweise 85% mit einer gewissen Anzahl falsch als erkrankt diagnostizierter Tiere gerechnet werden.