Nachweis und Charakterisierung der Endopeptidase-Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV)

Abstract

Die Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV, CD 26) ist ein dimeres Typ II- Membranprotein, das in zahlreichen Geweben und Zellen von Säugetieren vorkommt. Innerhalb des Clans SC der nicht-klassischen Serinpeptidasen wird die DPP IV der Prolyl-Oligopeptidase-Familie (S9) zugerechnet. Sie weist eine gut charakterisierte Exopeptidase-Aktivität mit bevorzugter Spaltung hinter Prolin und Alanin auf. Ob die DPP IV darüber hinaus auch eine Endopeptidase- Aktivität besitzt, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden. Zunächst wurde aktive DPP IV in einem dreistufigen Reinigungsverfahren, das als letzten Schritt eine Immunaffinitätschromatographie enthielt, isoliert. Das gereinigte Enzym wurde sowohl in einem Zymographie-Assay als auch in einem löslichen proteolytischen Assay zum Nachweis der spezifischen Endopeptidase- Aktivität der DPP IV eingesetzt. Dabei konnten die denaturierten fibrillären Kollagene der Typen I, II, III und V als Substrate der DPP IV-Endopeptidase- Aktivität identifiziert werden. Pro min wurden durch 1 mg der eingesetzten DPP IV-Präparation ungefähr 7,0 x 10-6 µmol der Typ I-Kollagen-Alpha-Ketten abgebaut, womit die Spaltungsrate als relativ niedrig zu bewerten ist. Denaturiertes Basalmembran-Kollagen (Typ IV) wurde deutlich langsamer hydrolysiert, während natives Kollagen, Albumin, Fibronektin und DPP IV selbst nicht verdaut wurden. Die höchste DPP IV-Endopeptidase-Aktivität wurde im physiologischen pH-Bereich bei 37°C beobachtet. Spaltprodukte wurden im Immunblot als relativ zahlreiche und diffuse Zwischenbanden sichtbar, so dass die DPP IV offenbar die Ketten des denaturierten Kollagens an zahlreichen Stellen spaltet. Bei Einsatz verschiedener Peptidase-Inhibitoren im löslichen proteolytischen Assay ergab sich für die Exo- und die Endopeptidase-Aktivität der DPP IV ein weitgehend übereinstimmendes Inhibitionsprofil, was auf ein gemeinsames katalytisches Zentrum schließen lässt. In immunhistochemischen Untersuchungen mit Anti-Kollagen I-Antikörpern wurden bei DPP IV-negativen Fischer 344-Ratten im Disse'schen Raum der Leber vermehrt faserartige Strukturen nachgewiesen, bei denen es sich wahrscheinlich um retikuläre Fasern handelt, deren Abbau offenbar infolge der fehlenden DPP IV-Expression gestört ist. Als mögliche biologische Funktionen der hier erstmals gezeigten DPP IV- Endopeptidase-Aktivität kommen eine Beteiligung am Kollagenkatabolismus, an Zelladhäsionsprozessen, an der Translokation von Zellen sowie an der Resorption von prolinhaltigen Peptiden in Frage.

Dipeptidyl peptidase IV (DPP IV, CD26) is a homodimeric type II membrane protein that is found on the cell surface of many solid tissues and different subtypes of lymphocytes in mammals. DPP IV is a member of the prolyl oligopeptidase family (S9) within the clan SC of non-classical serine peptidases. DPP IV is known to exhibit a well characterized exopeptidase activity specific for proline residues. This doctoral thesis describes a novel, specific endopeptidase activity of DPP IV. The enzyme was isolated in a three step purification procedure that included concanavalin A chromatography and immunoaffinity chromatography. The purified DPP IV was submitted to both a gelatin zymography assay and a soluble proteolytic assay in order to demonstrate and investigate its endopeptidase activity. Substrate specificity was detected for denatured fibrillar collagens (types I, II, III and V). Denatured basement membrane collagen type IV was also cleaved, but at a lower rate, whereas native collagens, albumin, fibronectin and the enzyme itself were not digested by DPP IV at all. 1 mg DPP IV was found to degrade 7 x 10-6 µmol of denatured type I collagen per min under optimal conditions of 37°C at pH 7.4. Cleavage products were detected on immunoblots as multiple peptide bands in a stepladder pattern, suggesting that DPP IV recognises multiple cleavage sites within the collagen chains. Endo- and exopeptidase activities of DPP IV showed the same peptidase inhibitor profile, including similar inhibition by DFP, PMSF and diprotin A and B, which suggests that both activities of DPP IV reside in a single active site. Immunohistochemical studies using anti-collagen-pAb revealed an accumulation of fibrillar collagen structures in the space of Disse of DPP IV-deficient Fischer-344-rats, indicating a disturbed collagen metabolism in these animals. The biological relevance of DPP IV endopeptidase activity should be seen in context with other collagenases and gelatinases, as well as with DPP IV exopeptidase activity. Therefore, DPP IV might participate in processes such as final collagen degradation, cellular adhesion to collagens, cellular translocation through the ECM and resorption of proline containing peptides.