dc.contributor.author
Bermpohl, Felix
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:54:56Z
dc.date.available
2002-09-18T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8600
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12799
dc.description
0 Titelblatt und Inhalt
Abstract
1 Einleitung und Zielsetzung
1.1 Die proteolytischen Enzyme
1.2 Aufbau, Vorkommen und Funktion der DPP IV
1.2.1 Die Struktur der DPP IV
1.2.2 Die Gewebeverteilung der DPP IV
1.2.3 Die Exopeptidase-Aktivität der DPP IV
1.2.4 Die Endopeptidase-Aktivität der DPP IV
1.3 Die Großfamilie der Kollagene
1.3.1 Das Bauprinzip der Kollagene
1.3.2 Die Kollagentypen
1.3.3 Der Kollagenkatabolismus
1.4 Zielsetzung
2 Versuchstiere, Material und Methoden
2.1 Versuchstiere
2.2 Material
2.2.1 Geräte
2.2.2 Chemikalien und Verbrauchswaren
2.2.3 Antikörper
2.2.4 Puffer
2.3 Methoden
2.3.1 Proteinchemische Methoden
2.3.1.1 Allgemeine proteinbiochemische Verfahren
2.3.1.1.1 Proteinbestimmung
2.3.1.1.2 Bestimmung der DPP IV-Exopeptidase-Aktivität
2.3.1.2 Verfahren zur Isolierung von Membranfraktionen
2.3.1.2.1 Gewinnung von Rohmembranen aus Nierenrinden
2.3.1.2.2 Solubilisierung von Membranproteinen
2.3.1.3 Chromatographische Verfahren
2.3.1.3.1 Dünnschichtchromatographie
2.3.1.3.2 Affinitätschromatographie an Concanavalin A-Sepharose
2.3.1.3.3 Immunaffinitätschromatographie an mAk 13.4-Sepharose
2.3.1.3.3.1 Kopplung des mAk 13.4 an Protein G-Sepharose
2.3.1.3.3.2 Immunaffinitätschromatographie an mAk 13.4-Sepharose
2.3.1.4 Elektrophoretische Verfahren
2.3.1.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
2.3.1.4.2 Western-Blotting
2.3.1.5 Färbungen von PAGE-Gelen
2.3.1.5.1 Coomassie-Blue G-250
2.3.1.5.2 Silberfärbung
2.3.1.6 Nachweisverfahren auf Blot-Matrices
2.3.1.6.1 Ponceau-Rot
2.3.1.6.2 Substratfärbung zum Nachweis aktiver DPP IV
2.3.1.6.3 Immunblot
2.3.1.7 Enzymatische Verdauungen
2.3.1.7.1 Gelatin-Zymographie
2.3.1.7.2 Löslicher proteolytischer Assay
2.3.2 Histochemische Methoden
2.3.2.1 Kryostatschnittherstellung
2.3.2.2 DPP IV-Aktivitätshistochemie
2.3.2.3 Kollagen-Immunhistochemie mit polyklonalen Primärantikörpern
3 Ergebnisse
3.1 Reinigung und Charakterisierung von DPP IV aus der Nierenrinde
3.1.1 Reinigung von aktiver DPP IV
3.1.2 Darstellung von DPP IV-Formen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
3.1.3 N-terminale Sequenzierung des 60 kD-Proteins
3.2 Etablierung zweier Assays zur Untersuchung gelatinolytisch aktiver
Peptidasen
3.2.1 Gelatin-Zymographie
3.2.1.1 Herstellung von Gelatingelen
3.2.1.2 Gelatin-Zymographie mit Clostridium histolyticum-Kollagenase
3.2.2 Löslicher proteolytischer Assay mit Clostridium-histolyticum-Kollagenase
3.2.2.1 Einfluss der Kollagenasemenge auf die Kollagenspaltung
3.2.2.2 Nachweis von niedermolekularen Spaltprodukten durch
Dünnschichtchromatographie
3.2.2.3 Nachweis von höhermolekularen Spaltprodukten bei niedrigeren
Inkubationstemperaturen
3.2.2.4 Zeitabhängigkeit der Kollagenspaltung
3.2.2.5 Verschiedene Substrate im löslichen proteolytischen Assay
3.2.2.6 Einsatz von Inhibitoren im löslichen proteolytischen Assay
3.2.2.7 Densitometrische Quantifizierung von Kollagenbanden
3.3 Nachweis der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität durch Gelatin-Zymographie
3.3.1 Einsatz der DPP IV-Präparation in den Zymographie-Assay
3.3.2 Einfluss von Elektrophoresebedingungen und Waschvorgang auf die
Gelatinzymographie mit DPP IV
3.3.3 Einfluss von DPP IV-Menge und Inkubationsdauer auf die Gelatinolyse
3.4 Charakterisierung der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität mit Hilfe des
löslichen proteolytischen Assays
3.4.1 Einfluss der EDTA-Konzentration auf den löslichen proteolytischen Assay
3.4.2 Einfluss des pH auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
3.4.3 Einfluss der Inkubationstemperatur auf die DPP IV-Endopeptidase-
Aktivität
3.4.4 Nachweis von Spaltprodukten durch Immunblotting
3.4.5 Untersuchungen zur Substrat-Spezifität der DPP IV-Endopeptidase-
Aktivität
3.4.5.1 Natives Albumin, Fibronektin und Kollagen im löslichen proteolytischen
Assay mit DPP IV
3.4.5.2 Die Spaltung denaturierten Kollagens der Typen I-V im Vergleich
3.4.6 Einfluss von Inhibitoren auf die DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
3.4.6.1 Diprotin A und B
3.4.6.2 Aspartat-, Cystein-, Metallo- und Serinpeptidase-Inhibitoren
3.5 Untersuchungen zum DPP IV-Defizit deutscher Fischer-344-Ratten
3.5.1 Die DPP IV-Expression in Wistar- und Fischer-Ratten
3.5.1.1 Analyse der Con A-Eluate des Nierenrinden-Rohmembran-Solubilisats
3.5.1.2 Enzymhistochemie
3.5.2 Immunhistochemie
4 Diskussion
4.1 Die Spaltung von denaturiertem Kollagen durch DPP IV als Beweis der
Endopeptidase-Aktivität
4.2 Ausschluss einer Kontamination
4.3 Die Spaltungsrate der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
4.4 Die Spaltprodukte der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
4.5 Die Spaltstellenspezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
4.6 Die Substratspezifität der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
4.7 Das katalytische Zentrum der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
4.8 Die Kollagenbindungsdomäne der DPP IV
4.9 Mögliche biologische Funktionen der DPP IV-Endopeptidase-Aktivität
4.9.1 Beteiligung am Kollagenkatabolismus
4.9.2 Beteiligung an Zelladhäsionsprozessen
4.9.3 Beteiligung an der Translokation von Zellen *
4.9.4 Beteiligung an der Resorption von prolinhaltigen Peptiden
4.9.5 Funktion in Leber, Speicheldrüsen, Pankreasgang und Prostata
4.10 Die DPP IV im Kontext anderer proteolytischer Enzyme
5 Literaturverzeichnis
dc.description.abstract
Die Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV, CD 26) ist ein dimeres Typ II-
Membranprotein, das in zahlreichen Geweben und Zellen von Säugetieren
vorkommt. Innerhalb des Clans SC der nicht-klassischen Serinpeptidasen wird
die DPP IV der Prolyl-Oligopeptidase-Familie (S9) zugerechnet. Sie weist eine
gut charakterisierte Exopeptidase-Aktivität mit bevorzugter Spaltung hinter
Prolin und Alanin auf. Ob die DPP IV darüber hinaus auch eine Endopeptidase-
Aktivität besitzt, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden.
Zunächst wurde aktive DPP IV in einem dreistufigen Reinigungsverfahren, das
als letzten Schritt eine Immunaffinitätschromatographie enthielt, isoliert.
Das gereinigte Enzym wurde sowohl in einem Zymographie-Assay als auch in einem
löslichen proteolytischen Assay zum Nachweis der spezifischen Endopeptidase-
Aktivität der DPP IV eingesetzt. Dabei konnten die denaturierten fibrillären
Kollagene der Typen I, II, III und V als Substrate der DPP IV-Endopeptidase-
Aktivität identifiziert werden. Pro min wurden durch 1 mg der eingesetzten DPP
IV-Präparation ungefähr 7,0 x 10-6 µmol der Typ I-Kollagen-Alpha-Ketten
abgebaut, womit die Spaltungsrate als relativ niedrig zu bewerten ist.
Denaturiertes Basalmembran-Kollagen (Typ IV) wurde deutlich langsamer
hydrolysiert, während natives Kollagen, Albumin, Fibronektin und DPP IV selbst
nicht verdaut wurden. Die höchste DPP IV-Endopeptidase-Aktivität wurde im
physiologischen pH-Bereich bei 37°C beobachtet. Spaltprodukte wurden im
Immunblot als relativ zahlreiche und diffuse Zwischenbanden sichtbar, so dass
die DPP IV offenbar die Ketten des denaturierten Kollagens an zahlreichen
Stellen spaltet. Bei Einsatz verschiedener Peptidase-Inhibitoren im löslichen
proteolytischen Assay ergab sich für die Exo- und die Endopeptidase-Aktivität
der DPP IV ein weitgehend übereinstimmendes Inhibitionsprofil, was auf ein
gemeinsames katalytisches Zentrum schließen lässt. In immunhistochemischen
Untersuchungen mit Anti-Kollagen I-Antikörpern wurden bei DPP IV-negativen
Fischer 344-Ratten im Disse'schen Raum der Leber vermehrt faserartige
Strukturen nachgewiesen, bei denen es sich wahrscheinlich um retikuläre Fasern
handelt, deren Abbau offenbar infolge der fehlenden DPP IV-Expression gestört
ist. Als mögliche biologische Funktionen der hier erstmals gezeigten DPP IV-
Endopeptidase-Aktivität kommen eine Beteiligung am Kollagenkatabolismus, an
Zelladhäsionsprozessen, an der Translokation von Zellen sowie an der
Resorption von prolinhaltigen Peptiden in Frage.
de
dc.description.abstract
Dipeptidyl peptidase IV (DPP IV, CD26) is a homodimeric type II membrane
protein that is found on the cell surface of many solid tissues and different
subtypes of lymphocytes in mammals. DPP IV is a member of the prolyl
oligopeptidase family (S9) within the clan SC of non-classical serine
peptidases. DPP IV is known to exhibit a well characterized exopeptidase
activity specific for proline residues. This doctoral thesis describes a
novel, specific endopeptidase activity of DPP IV. The enzyme was isolated in a
three step purification procedure that included concanavalin A chromatography
and immunoaffinity chromatography. The purified DPP IV was submitted to both a
gelatin zymography assay and a soluble proteolytic assay in order to
demonstrate and investigate its endopeptidase activity. Substrate specificity
was detected for denatured fibrillar collagens (types I, II, III and V).
Denatured basement membrane collagen type IV was also cleaved, but at a lower
rate, whereas native collagens, albumin, fibronectin and the enzyme itself
were not digested by DPP IV at all. 1 mg DPP IV was found to degrade 7 x 10-6
µmol of denatured type I collagen per min under optimal conditions of 37°C at
pH 7.4. Cleavage products were detected on immunoblots as multiple peptide
bands in a stepladder pattern, suggesting that DPP IV recognises multiple
cleavage sites within the collagen chains. Endo- and exopeptidase activities
of DPP IV showed the same peptidase inhibitor profile, including similar
inhibition by DFP, PMSF and diprotin A and B, which suggests that both
activities of DPP IV reside in a single active site. Immunohistochemical
studies using anti-collagen-pAb revealed an accumulation of fibrillar collagen
structures in the space of Disse of DPP IV-deficient Fischer-344-rats,
indicating a disturbed collagen metabolism in these animals. The biological
relevance of DPP IV endopeptidase activity should be seen in context with
other collagenases and gelatinases, as well as with DPP IV exopeptidase
activity. Therefore, DPP IV might participate in processes such as final
collagen degradation, cellular adhesion to collagens, cellular translocation
through the ECM and resorption of proline containing peptides.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
dipeptidyl peptidase IV
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Nachweis und Charakterisierung der Endopeptidase-Aktivität der
Dipeptidylpeptidase IV (DPP IV)
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. med. Werner Reutter
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. med. Friedrich Körber
dc.date.accepted
2002-09-13
dc.date.embargoEnd
2002-09-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002001918
dc.title.translated
Demonstration and characterization of the endopeptidase activity of dipeptidyl
peptidase IV (DPP IV)
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000562
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/191/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000562
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