Isolierung und Identifizierung von Diguanosinhexaphosphat aus bovinem Nebennierengewebe

Abstract

In den letzten Jahren wurden Dinukleosidpolyphosphate als Hormone bzw. Neurotransmitter cha-rakterisiert. Die Substanzgruppe der Dinukleosidpolyphosphate zeichnet sich durch ihre vason-konstringierende beziehungsweise proliferationssteigernde Wirkung aus, die im besonderen im Rahmen der Pathogenese der arteriellen Hyertonie und der Atherosklerose von Bedeutung sein könnte. In der Gruppe der Dinukleosidpolyphosphate zeichnen sich die Diguanosinpolyphosphate die stärkste proliferationssteigernde Wirkung aus. Bisher konnten die Diguanosinpolyphosphate im menschlichen Organismus einzig in Thrombo-zyten nachgewiesen werden. Da jedoch Diadenosinpolyphosphate und Adenosinguanosinpo-lyphosphate sowohl in Thrombozyten als auch in der Nebennieren nachgewiesen worden sind, wurde in der vorliegenden Dissertation der Frage nachgegangen, ob Diguanosinpolyphosphate auch im Nebennierengewebe nachweisbar sind und ihnen damit eine Funktion in der Kreislauf-physiologie zukommt. Als exemplarischer Vertreter der Diguanosinpolyphosphate wurde das Diguanosinhexaphosphat (Gp6G) gewählt, da diese Substanz durch einen sehr deutlichen wachstumstimulierenden Effekt auf glatte Gefässmuskelzellen charakterisiert ist. Zur Isolierung des Diadenosinpolyphosphate und Adenosinguanosinpolyphosphate wurde bovines Nebennierengewebe gefriergetrocknet und deproteiniert. Das Organextrakt wurde einer präparativen Reversed-Phase-Chromatographie zu-geführt. Die weitere Auftrennung erfolgte mittels einer Grössenausschluss- und einer Affinitäts-Chromatographie. Anschliessend erfolgte eine Reversed-Phase-Displacement- und Anionenaus- tausch-Chromatographie. Mittels der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions / Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) wurde das molekulare Gewicht der Probensubstanz be-stimmt. Die MALDI-MS zeigte Massensignale bei 1029 Dalton und 1068 Dalton. Die Sequenzie-rung der isolierten Substanz mittels Post- Source-Decay-MALDI-MS ergab Massensignale, die sich Fragmenten des Gp6G zuordnen liessen. Zur Verifizierung der molekularen Struktur wurden enzymatische Spaltungsversuche durchgeführt, die zeigten, dass eine 5 ´-Phosphodiester-bindung zwischen der Phosphatkette und den Ribosen der Guanosingruppen vorhanden ist. Das Ergebnis der vorliegenden Arbeit zeigt, dass das Gp6G nicht nur in Thrombozyten nachweis-bar ist, sondern auch im Nebennierengewebe und dadurch direkten Einfluss auf die Kreislaufphy-siologie haben kann.

Dinucleoside polyphosphates have been characterised as extracellular mediators controlling numerous physiological funktions like vascular tone or cell proliferation. Here described is the isolation and identification of diguanosine hexaphosphates from adrenal glands. The diguanosine hexaphosphates were identified by fractionating them to homogeneity by preparative size- exclusion- and affinity-chromatography as well as analytical anion-exchange and reversed-phase-chromatography from deproteinized adrenal glands and by analysis of the homogoenous fractions with PSD- and MALDI- mass spectrometry. The identity of the diguanosine hexaphosphates was confirmed by retention time comparison with authentic diguanosine hexaphosphates. Enzymatic analysis demonstrated an interconnection of the phosphate groups with the adenosines in the 5´positions of the riboses in the diguanosine hexaphosphates purified from adrenal glands. In conclusion, the identification of these diguanosine hexaphosphates in adrenal gland emphazises that these dinucleoside polyphosphates may be released from adrenal glands upon stimulation into circulation