Untersuchungen zum Einfluss von Inulin und thermisch behandelten Ackerbohnen auf immunologische Parameter bei Sauen, Saug- und Absetzferkeln

Abstract

Das Immunsystem ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Ferkeln. Die Zusammensetzung des Futters sowie die Behandlung einzelner Futterkomponenten können Immunmechanismen beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es daher, den möglichen immunmodulatorischen Einfluss von Inulin sowie getoasteten und extrudierten Ackerbohnen (Vicia faba L.) zu überprüfen. Hierfür wurden Untersuchungen an Sauen sowie Saug-und Absetzferkeln im Rahmen von zwei separaten Versuchsdurchgängen durchgeführt. Insgesamt 21 trächtige Sauen wurden gleichmäßig auf zwei Versuchsgruppen aufgeteilt. Die Sauen erhielten ein Trächtigkeits¬beziehungsweise Laktationsfutter ohne (Kontrollgruppe) oder mit (Inulingruppe) 3% Inulin. Am 1., 5. (±1) und 14. (±1) Tag post partum (p.p.) wurden Milchproben für eine Leukozytenphänotypisierung sowie zur Bestimmung der Immunglobulingehalte von den Sauen gewonnen, am fünften Tag p.p. erfolgte zudem eine Blutentnahme zur Bestimmung der Immunglobulingehalte im Serum der Tiere. Die Ferkel der Sauen wurden entsprechend der Fütterung der Muttertiere ebenfalls in eine Kontroll- und eine Inulingruppe eingeteilt. Die Saugferkel erhielten ab dem 14. Lebenstag ein Saugferkelbeifutter ohne beziehungsweise mit 3% Inulin. Insgesamt 16 Saugferkel wurden am zehnten Lebenstag euthanasiert, um Blut-und Darmproben für eine Leukozytenphänotypisierung und -proliferation sowie für eine Immunglobulinbestimmung im Serum zu gewinnen. Die verbliebenen Saugferkel der Kontroll-und Inulingruppe wurden mit 42 Tagen abgesetzt und, entsprechend ihrer bisherigen Fütterung ohne beziehungsweise mit Inulin, auf zwei Kontroll- sowie auf zwei Inulingruppen aufgeteilt. Jeweils eine Kontroll-und eine Inulingruppe der Ferkel erhielt ein Aufzuchtfutter mit getoasteten Ackerbohnen, die anderen beiden Gruppen erhielten das Aufzuchtfutter mit extrudierten Ackerbohnen. Das Futter der Inulingruppen enthielt zusätzlich jeweils 3% Inulin. Somit ergab sich für die Absetzferkel folgende Gruppenaufteilung: Kontrollgruppe mit getoasteten Ackerbohnen, Kontrollgruppe mit extrudierten Ackerbohnen, Inulingruppe mit getoasteten Ackerbohnen, Inulingruppe mit extrudierten Ackerbohnen. Am 59. (±1) Lebenstag wurden pro Gruppe insgesamt acht Absetzferkel euthanasiert, um Blut-und Darmproben für eine Leukozytenphänotypisierung und -proliferation sowie für eine Immunglobulinbestimmung im Serum zu gewinnen. Die Immunzellsubpopulationen aus der Milch, dem Blut und aus der Lamina epithelialis des Darms wurden mit primären und sekundären Antikörpern gefärbt und durchflusszytometrisch bestimmt. Zur Beurteilung der Proliferationsleistung wurden die Lymphozyten aus dem Blut und aus dem Darm mit den Mitogenen Pokeweed Mitogen (PWM), Phythämagglutinin M (PHA-M) und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Der Immunglobulingehalt der Klassen G, A und M in der Milch sowie im Serum wurde mit Hilfe eines Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) ermittelt. Zusätzlich zu den Bestimmungen der Immunparameter erfolgte eine Erfassung von Leistungsdaten (Anzahl der lebend und tot geborenen sowie abgesetzten Ferkel, Futteraufnahme, Futteraufwand, Lebendmassenzunahme). Der altersassoziierte Vergleich zwischen den Saug-und Absetzferkeln ergab sowohl im Rahmen der Phänotypisierung der Lymphozyten aus dem Blut als auch aus dem Darm deutliche Unterschiede in den Gehalten der detektierten Leukozytenpopulationen (T-Zellen (CD2+CD5+), B-Zellen (CD21+), NK-Zellen (CD2+CD5-) und myeloide Zellen (SWC3+)) sowie der entsprechenden Subpopulationen (T-Helfer-Zellen (CD4+CD8α-), zytotoxische T-Zellen (CD4-CD8α+), γδ-T-Zellen Zellen (TCR1+) und Makrophagen/Monozyten (CD14+)). Hinsichtlich der Immunglobulingehalte im Serum wiesen die Sauen und Saugferkel höhere absolute Gehalte als die Absetzferkel auf, wohingegen das Verteilungsmuster von IgG, IgM und IgA zwischen den Sauen und Absetzferkeln ähnlich und von dem ermittelten Immunglobulinmuster im Serum der Saugferkel verschieden war. Die Untersuchung der immunologischen Zusammensetzung der Sauenmilch ergab deutliche zeitabhängige Veränderungen hinsichtlich der Gehalte der detektierten Leukozytenmarker, mit einer generellen Abnahme der Lymphozytenmarker vom ersten zum 14. Tag p.p. sowie einer Abnahme der Marker zum Nachweis myeloider Zellen vom ersten zum fünften und einem anschließenden Anstieg vom fünften zum 14. Laktationstag. Die Immunglobulingehalte nahmen im Verlauf der Laktationsperiode deutlich ab, zudem erfolgte eine Verschiebung des Verteilungsmusters. Während im Kolostrum IgG dominierte und IgA und IgM zu etwa gleichen Anteilen vorhanden waren, machten am fünften Tag post partum IgG den geringsten und IgM den höchsten Anteil der Immunglobuline in der Sauenmilch aus. Am 14. Laktationstag dominierte schließlich IgA, gefolgt von IgM und IgG. Hinsichtlich eines möglichen fütterungsassoziierten Einflusses auf immunologische Parameter zeigte sich in der Sauenmilch am ersten Tag p.p. ein signifikant höherer Anteil CD21+-Zellen sowie am 14. Tag p.p. eine höhere Anzahl CD4-CD8α+-, CD4+CD25--und CD5+MHCII+-Zellen in der Inulingruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Fütterung von Inulin sowie getoasteten beziehungsweise extrudierten Ackerbohnen hatte keinen Einfluss auf die ermittelten Leistungsdaten der Sauen und Ferkel. Ebenfalls konnten keine Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen im Rahmen der Phänotypisierung der peripheren mononukleären Blutzellen sowie der intraepithelialen Lymphozyten des Darms festgestellt werden. Der Proliferationstest der Lymphozyten aus dem Blut ergab bei den Saugferkeln einen höheren Anteil Con A-stimulierter Zellen in der Kontrollgruppe im Vergleich zu der Inulingruppe, wohingegen bei den Absetzferkeln keine Unterschiede zwischen den Gruppen feststellbar waren. Die Proliferation der intraepithelialen Lymphozyten aus dem Darm führte durch den Einsatz von PHA-M zu einem höheren Anteil stimulierter Zellen in der Fütterungsgruppe, die getoastete Ackerbohnen und Inulin bekam, im Vergleich zu der Kontroll-und Inulingruppe, die extrudierte Ackerbohnen erhielten. Für die Immunglobulingehalte im Serum der Sauen und Saugferkel konnten keine Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen festgestellt werden, wohingegen bei den Absetzferkeln die Tiere in der Inulingruppe, unabhängig davon, ob sie getoastete oder extrudierten Ackerbohnen erhielten, signifikant erhöhte IgM- Gehalte im Vergleich zu der Kontrollgruppe aufwiesen. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnten Subpopulationen der Immunzellen im Blut, in der Lamina epithelialis des Darms und in der Milch von Schweinen weitgehend quantifiziert und somit, unter zusätzlicher Bestimmung der Immunglobulingehalte im Serum und in der Milch der Tiere, Aspekte der immunologischen Entwicklung von Saug-und Absetzferkeln beschrieben werden. Der Einsatz von Inulin sowie von getoasteten und extrudierten Ackerbohnen konnte nur in wenigen Fällen eine immunmodulatorische Wirkung aufzeigen. Dennoch sollte aufgrund der beobachteten Aktivierung des Immunsystems durch den Einsatz von Inulin im Futter der Sauen und Ferkel im Rahmen von Folgeuntersuchungen die physiologische Bedeutung der nachgewiesenen Ergebnisse näher ermittelt werden.

The immune system is of decisive importance for an adequate development of piglets. Diet composition and condition can modulate immune function in different ways. Aim of this study was to determine the potential immunomodulatory effect of inulin and toasted or extruded faba beans (Vicia faba L.). For this purpose investigations were focused on sows, suckling and weaned piglets, resulting in two separate trials in two different years. In total, 21 gravid sows were divided into two groups, receiving either a control diet or a diet with 3% inulin (total concentration). The diets were fed from three weeks ante partum (a.p.) to six weeks post partum (p.p.). On days 1, 5 (±1) and 14 (±1) p.p. milk samples were taken for leukocyte differentiation and immunoglobulin determination. Additionally, blood samples for immunoglobulin determination were taken on day five p.p.. Considering the feeding groups of the sows, the suckling piglets were divided into a control and inulin group. After two weeks of life, piglets were fed with an additional feed without (control group) or with a total concentration of 3% inulin (inulin group). 16 suckling piglets were sacrificed on day ten post partum and blood for leukocyte characterisation, lymphocyte proliferation test and immunoglobulin determination was drawn. Additionally, tissue samples were taken from the middle of the jejunum for leukocyte characterisation and lymphocyte proliferation test. The remaining suckling piglets of the two feeding groups were weaned with an age of 42 days and divided in two control and two inulin groups, considering the previous feeding. Piglets of one control and one inulin group each received a diet with toasted faba beans or extruded faba beans, resulting in the following group allocation: control group with toasted faba beans, control group with extruded faba beans, inulin group with toasted faba beans, inulin group with extruded faba beans. Diets of the inulin groups were supplemented with 3% inulin (total concentration). Eight weaned piglets of each feeding group were sacrificed on day 59 (±1) post partum and blood for leukocyte characterisation, lymphocyte proliferation test and immunoglobulin determination was drawn. Tissue samples were taken from the middle of the jejunum for leukocyte characterisation and lymphocyte proliferation test. Immune cell subpopulations in milk, blood and the intestinal Lamina epithelialis were stained with a panel of primary and secondary leukocyte antibodies and determined by flow cytometry. Proliferative activity of peripheral blood and intestinal intraepithelial lymphocytes was tested after stimulation with the mitogens Pokeweed Mitogen (PWM), Phythämagglutinin M (PHA-M) and Concanavalin A (Con A). To determine the amounts of the immunoglobulins IgG, IgA and IgM in the milk and serum, a commercial Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was used. In addition to the measurement of the immune parameters, performance data were assessed (living, stillborn and weaned piglets, feed intake, feed conversion ratio, weight gain). The comparison of the suckling and weaned piglets demonstrated significant differences in expression of the measured leukocyte surface markers in the blood and intestinal Lamina epithelialis (αβ-T-cells and CD2+-γδ-T-cells (CD2+CD5+), B-cells (CD21+), Nk-cells (CD2+CD5-), myeloid cells (SWC3+), T-helper cells (CD4+CD8α-), cytolytic T-cells (CD4¬CD8α+), γδ-T-cells (TCR1+) and macrophages / monocytes (CD14+)). Sows and suckling piglets showed higher amounts of immunoglobulins in the serum compared to the weaned piglets; however, pattern of immunoglobulin classes (IgG, IgA, IgM) was similar in weaned piglets and sows but different to the suckling piglets. The characterisation of leukocytes in sow milk at different time points after parturition indicated significant time dependent changes of leukocyte composition with a general trend to reduction of lymphocyte surface markers during the lactation period, but only a decrease of surface markers expressed on myeloid cells until day five p.p. and a subsequent increase until day 14 p.p.. Amounts of immunoglobulins decreased during the lactation period, and pattern of immunoglobulin classes changed. As IgG dominated in colostrum and IgA and IgM showed similar concentrations, on day five post partum amounts of IgM were distinctly higher than amounts of IgA and IgG. On day 14 post partum IgA dominated in milk with subsequently higher concentrations of IgM compared to IgG. With respect to the impact of inulin on immunological parameters in sow milk, significant higher numbers of CD21+-cells (day 1 p.p.), CD4-CD8α+-, CD4+CD25--and CD5+MHCII+-cells (day 14 p.p.) were found in the inulin group compared to the control group. No dietary effect was noted for performance data of sows and piglets. In addition, no differences between feeding groups were recognized for the measured immune cell populations in the blood and intestinal Lamina epithelialis. The measurement of proliferative activity of peripheral blood lymphocytes demonstrated a higher percentage of Con A¬stimulated cells in the control group of the suckling piglets compared to the inulin group, but no differences between feeding groups of the weaned piglets. With respect to the proliferative activity of the intestinal intraepithelial lymphocytes, a higher number of PHA-M-stimulated cells were noted in the inulin group fed toasted faba beans compared to the control and inulin group with extruded faba beans. No differences between feeding groups were noted for the determination of immunoglobulins in the serum of sows and suckling piglets, however, weaned piglets in the inulin groups showed higher concentrations of IgM compared to the control group, with no additional effect of heat-processed faba beans. In conclusion, the present study provides a detailed quantification of immune cells in the blood, intestinal Lamina epithelialis and milk of pigs, and an additional determination of immunoglobulins in the serum and milk, resulting in a characterization of partial aspects of immunological development in suckling and weaned piglets. The influence of inulin or different heat-processed faba beans on immunological parameters seems to be low. However, due to the demonstrated activating effects of inulin on the immune system, continuing studies are needed for further evaluation of the physiological meaning of the present results.