dc.contributor.author
Protze, Jonas
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:52:34Z
dc.date.available
2015-02-27T09:43:05.796Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8547
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12746
dc.description.abstract
Claudine (Cld) sind essentielle Bestandteile der “Tight Junctions” (TJs) und
verantwortlich für die Aufrechterhaltung dieser Zell-Zell-Kontakte. Die
Bin¬dung der C-terminalen Domäne von Clostridium perfringens Enterotoxin
(cCPE) an die extrazelluläre Schleife 2 (EZS2) der Claudine, insbesondere von
Cld3, Cld4 und Cld6–Cld9, verursacht eine reversible Öffnung der TJs. Eine
Struktur-Funktionsanalyse des Systems ist daher für biomedizinische
Anwendungen relevant, da cCPE im Prinzip zur Steigerung der parazellulären
Wirkstoffaufnahme eingesetzt werden kann. Außerdem könnte cCPE oder CPE zur
Diagnostik bzw. zur Behandlung von Cld3 oder Cld4 überexprimiernden Karzinomen
verwendet werden. Es wäre auch wünschenswert, wenn cCPE an Cld5 binden würde
um so die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Cytostatika im Falle von
Hirntumoren zu erhöhen. Dazu muss die Spezifität von cCPE jedoch
umprogrammiert werden. Die Determinanten der cCPE-Cld-Interaktion und
insbesondere der Spezifität der cCPE-Bindung an bestimmte Cld-Subtypen waren
bisher jedoch unklar, da keine strukturellen Informationen zu Claudinen
verfügbar sind. Daher wurden im Zuge dieser Arbeit durch Kombination von
strukturbioinformatischen Ansätzen und experimentellen molekularbiologischen
Methoden detaillierte Strukturmodelle der Interaktion von cCPE mit den EZS2
von Cld3 und Cld4 ausgearbeitet. Diese wurden für das Design einer cCPE-
Variante mit Cld5-Subtypspezifität verwendet. In einem weiteren Projektteil
wurde cCPE durch Ankopplung eines Fluorophors sowie eines Käfigmoleküls für
Xenon chemisch modifiziert und somit die ersten Schritte zur Verwendung als
diagnostische Sonde zur Detektion einer Überexpression bestimmter Claudin-
Subtypen unternommen. Im Einzelnen wurde anhand der Kristallstruktur von cCPE
sowie aufgrund der Ergebnisse zellulärer Bindungstudien eine vollständige
Kartierung und Charakterisierung der Claudin-Bindungstasche durchgeführt.
Daraufhin wurden Homologiemodelle der EZS2 von Cld3 und Cld4 erstellt und
cCPE-Cld-Interaktionsmodelle zwischen der Kristallstruktur von cCPE und der
EZS2 von Claudin generiert. Durch gezielte Aminosäuresubstitutionen sowohl auf
Claudin- als auch auf cCPE-Seite konnte eine Schlüsselinteraktion der Bindung
identifiziert werden. Die hydrophobe Seitenkette von L150/151 (Cld3/Cld4)
interagiert mit einer stark hydrophoben Vertiefung in der Cld-Bindungstasche
von cCPE, welche durch Y306, Y310 und Y312 (Tripel-Tyr-Tasche) gebildet wird.
So konnte die Orientierung der EZS2 in der Cld-Bindungstasche festgelegt
werden. Durch Übertragung der Erkenntnisse aus den Untersuchungen zur Bindung
von cCPE an Cld3 und Cld4 auf Cld1 und Cld5, Sequenzvergleiche der EZS2 von
klassischen Claudinen sowie daran anschließende Bindungsstudien wurden je zwei
Aminosäuren in der EZS2 von Cld1 (D150, T153) und Cld5 (D149, T151)
identifiziert, welche die cCPE-Bindung schwächen (Cld1) bzw. verhindern
(Cld5). Unter Verwendung der Interaktionsmodelle konnten nun Varianten von
cCPE mit veränderter Cld-Bindungstasche designed werden, die an Cld5 binden
können. Durch Substitution eines Tyrosins (Y306) zu Tryptophan wurde die
Tripel-Tyr-Tasche von cCPE verkleinert. Diese Verkleinerung in Kombination mit
einem, die Cld-Bindungstasche verengenden, Austausch eines Serins (S313) zu
Histidin ergab eine cCPE-Variante mit nanomolarer Affinität für Cld5 bei
gleichzeitig schlechterer Bindung an die klassischen CPE-Rezeptor-Claudine
(Cld3, Cld4, Cld6–Cld9). Neben der Charakterisierung der cCPE-Cld-Interaktion
wurde im Zuge dieser Arbeit auch ein vollständiges Modell von Cld5 anhand der
von Jan Rossa experimentell ermittelten Daten in Verbindung mit evolutionären
Kontakten generiert. Dieses Modell liefert erste Einblicke in die räumliche
Orientierung der 4 Transmembranhelices von Claudinen zueinander und kann zur
Entschlüsselung der komplexen cis\- und trans-Interaktionen der Claudine
beitragen, welche eine entscheidende Rolle bei der Funktion und Organisation
der “Tight Junctions” spielen. Das Hauptergebnis dieser Arbeit ist eine
gezielte Veränderung des Bindungsverhaltens von cCPE, welches nativ nicht an
Cld5 bindet. Durch rational gewählte Doppelsubstitutionen in cCPE
(Y306W/S313H) wurde eine Bindung mit nanomolarer Affinität an Cld5 erreicht.
Diese neue cCPE-Variante (cCPEY306W/S313H) bietet eine Grundlage zur
Entwicklung eines Cld5-spezifischen Binders und ist ein prinzipieller Nachweis
dafür, dass auf Basis von cCPE auch cCPE-Varianten mit starker Bindung an
nicht-CPE-Rezeptor-Claudine generiert werden können. Zusätzlich wurden in
dieser Arbeit auch cCPE-Varianten mit verbesserter Spezifität für Cld3
(cCPEL223A/D225A/R227A) und Cld4 (cCPEL254A/S256A/I258A/D284A) erstellt. Somit
ist es zum ersten Mal möglich, mit cCPE-Varianten bestimmte Cld-Subtypen
gezielt zu binden bzw. von der Bindung auszuschließen – ein wichtiger Schritt
zur Entwicklung von cCPE als TJ-Modulator, “Drug Delivery”-System oder zur
Detektion bzw. Behandlung von Cld überexprimierenden Krebszellen. Darüber
hinaus liefern die weiteren Ergebnisse der Arbeit detaillierte Einblicke in
die molekulare Struktur und Funktionsweise der Claudine bzw. der cCPE-Claudin-
Interaktion, die neue Möglichkeiten für die pharmakologische Entwicklung cCPE-
oder CPE-basierender Cld-subtypspezifischer Claudin-Binder eröffnen. Das mit
experimentellen Daten verifizierte vollständige Modell von Cld5 ist außerdem
eine gute Grundlage für weiterführende Studien, die mittels gezielter
Aminosäuresubstitutionen die Oligomerisierung und Organisation von Claudinen
in “Tight Junctions” untersuchen.
de
dc.description.abstract
Claudins are essential constituents of Tight Junctions (TJs) and responsible
for maintenance of these cell-cell contacts. Binding of Clostridium
perfringens Enterotoxin’s C-terminal domain (cCPE) to the extracellular loop 2
(EZS2) of claudins, especially Cld3, Cld4 and Cld6-Cld9 causes a reversible
opening of TJs. Thus, a structure-function analysis of this system is relevant
for biomedical application, since cCPE could be used to enhance paracellular
drug uptake. Furthermore cCPE respectively CPE could be used for detection or
treatment of Cld3 or Cld4 overexpressing carcinomas. Particularly a Cld5
binding cCPE-variant would be of interest to enhance the permeability of the
blood-brain barrier for cytostatics in cases of brain-tumours. However, this
needs reprogramming of cCPE’s specificity. Determinants of the cCPE-claudin
interaction and cCPE’s specificity for certain Cld-subtyps remained unclear,
since no structural information is available for claudins. Therefore, in the
course of this work, detailed structural models of cCPE with the EZS2 of Cld3
and Cld4 were created by combining structural bioinformatics and methods of
molecular biology in an iterative process. Subsequently, these Models were
used to obtain a rational designed cCPE-variant with shifted Cld-subytyp
specificity towards Cld5. Furthermore, first steps towards a usage of cCPE as
a diagnostic probe to detect overexpression of certain Cld-subtypes were taken
by chemical modification of cCPE with fluorophores as well as a cage compound
for Xenon. In detail, utilizing cCPE’s crystal structure and the results of
cellular binding studies a full mapping and characterisation of cCPE’s Cld-
binding pocket was carried out and homology models of the EZS2 of Cld3 and
Cld4, as well as cCPE-Cld interaction models, were created. Moreover, by
directed substitution of residues in cCPE and claudins, one of the key
interactions of cCPE-Cld binding was identified, and the orientation of the
EZS2 in cCPE’s Cld-binding pocket was determined. L150/151 (Cld3/4) interacts
with a deep and strongly hydrophobic pit within the Cld-binding pocket, which
is formed by Y306, Y310 and Y312 (triple-Tyr pit). Transfer of the knowledge
gained by studying cCPE’s binding to Cld3 and Cld4 to Cld1 and Cld5, sequence
comparison of the EZS2 of classic claudins, as well as following binding
studies, resulted in the identification of two residues each within the EZS2
of Cld1 and Cld5, which weaken (Cld1) or block (Cld5) the interaction with
cCPE. Consequently, the interaction models were utilized to design cCPE-
variants with a changed Cld-binding pocket, allowing binding to Cld5. By
downsizing the triple-Tyr pit of cCPE with a substitution of tyrosine (Y306)
to tryptophan, in combination with a substitution of serine (S313) to
histidine, which narrows the Cld-binding pocket, a cCPE-variant with nanomolar
affinity for Cld5 was created. This new cCPE-variant (cCPEY306W/S313H) also
shows decreased binding to classic CPE-receptor claudins (Cld3, Cld4,
Cld6-Cld9). Apart from characterizing the cCPE-Cld interaction, a full model
of Cld5 was established. This model is based on experimental data, determined
by Jan Rossa as well as evolutionary contacts. It provides first insights into
the arrangement of the 4 transmembrane helices of claudins and is also useful
to unravel the complex cis\- and trans-interactions of claudins, which have a
crucial role in organisation and function of tight junctions. The main result
of this study is that two rational chosen substitutions (Y306W/S313H) change
cCPE’s binding behaviour to bind Cld5 with a nanomolar affinity. This new
cCPE-Variant (cCPEY306W/S313H) provides a good basis for development of a
Cld5-specific binder and is a proof of principle that cCPE can be used to
design variants targeting non-CPE-re¬cep¬tor claudins. Additionally, two cCPE-
variants with improved specificity for Cld3 (cCPEL223A/D225A/R227A) and Cld4
(cCPEL254A/S256A/I258A/D284A) were generated in the course of this work. Thus,
it is now for the first time possible to selectively target distinct Cld-
subtypes with cCPE-variants, an important step for the development of cCPE as
TJ-modulator, drug delivery system or tool for detection and treatment of
claudin overexpressing tumours. In sum, the results provide detailed insights
into the molecular structure and function of claudins and the cCPE-claudin
interaction, which on the one hand contribute to new possibilities for the
pharmacological development of subtype specific Cld-binders based on CPE and
cCPE. On the other hand, the experimentally verified full model of Cld5 now
allows to study oligomerisation and organisation of claudins in tight
junctions by targeted substitutions.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Tight junctions
dc.subject
Protein–protein interactions
dc.subject
Membrane proteins
dc.subject
Structure–function study
dc.subject
Molecular modeling
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Molekulare Analyse der Interaktion zwischen Clostridium perfringens
Enterotoxin und Claudinen
dc.contributor.contact
JonasProtze@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
Dr. Gerd Krause
dc.contributor.furtherReferee
Dr. Hartmut Oschkinat
dc.date.accepted
2015-01-13
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000098506-2
dc.title.translated
Molecular analysis of the interaction between Clostridium perfringens
Enterotoxin and Claudins
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000098506
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000016510
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open access