Molekulare Analyse der Interaktion zwischen Clostridium perfringens Enterotoxin und Claudinen

Abstract

Claudine (Cld) sind essentielle Bestandteile der “Tight Junctions” (TJs) und verantwortlich für die Aufrechterhaltung dieser Zell-Zell-Kontakte. Die Bin¬dung der C-terminalen Domäne von Clostridium perfringens Enterotoxin (cCPE) an die extrazelluläre Schleife 2 (EZS2) der Claudine, insbesondere von Cld3, Cld4 und Cld6–Cld9, verursacht eine reversible Öffnung der TJs. Eine Struktur-Funktionsanalyse des Systems ist daher für biomedizinische Anwendungen relevant, da cCPE im Prinzip zur Steigerung der parazellulären Wirkstoffaufnahme eingesetzt werden kann. Außerdem könnte cCPE oder CPE zur Diagnostik bzw. zur Behandlung von Cld3 oder Cld4 überexprimiernden Karzinomen verwendet werden. Es wäre auch wünschenswert, wenn cCPE an Cld5 binden würde um so die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke für Cytostatika im Falle von Hirntumoren zu erhöhen. Dazu muss die Spezifität von cCPE jedoch umprogrammiert werden. Die Determinanten der cCPE-Cld-Interaktion und insbesondere der Spezifität der cCPE-Bindung an bestimmte Cld-Subtypen waren bisher jedoch unklar, da keine strukturellen Informationen zu Claudinen verfügbar sind. Daher wurden im Zuge dieser Arbeit durch Kombination von strukturbioinformatischen Ansätzen und experimentellen molekularbiologischen Methoden detaillierte Strukturmodelle der Interaktion von cCPE mit den EZS2 von Cld3 und Cld4 ausgearbeitet. Diese wurden für das Design einer cCPE- Variante mit Cld5-Subtypspezifität verwendet. In einem weiteren Projektteil wurde cCPE durch Ankopplung eines Fluorophors sowie eines Käfigmoleküls für Xenon chemisch modifiziert und somit die ersten Schritte zur Verwendung als diagnostische Sonde zur Detektion einer Überexpression bestimmter Claudin- Subtypen unternommen. Im Einzelnen wurde anhand der Kristallstruktur von cCPE sowie aufgrund der Ergebnisse zellulärer Bindungstudien eine vollständige Kartierung und Charakterisierung der Claudin-Bindungstasche durchgeführt. Daraufhin wurden Homologiemodelle der EZS2 von Cld3 und Cld4 erstellt und cCPE-Cld-Interaktionsmodelle zwischen der Kristallstruktur von cCPE und der EZS2 von Claudin generiert. Durch gezielte Aminosäuresubstitutionen sowohl auf Claudin- als auch auf cCPE-Seite konnte eine Schlüsselinteraktion der Bindung identifiziert werden. Die hydrophobe Seitenkette von L150/151 (Cld3/Cld4) interagiert mit einer stark hydrophoben Vertiefung in der Cld-Bindungstasche von cCPE, welche durch Y306, Y310 und Y312 (Tripel-Tyr-Tasche) gebildet wird. So konnte die Orientierung der EZS2 in der Cld-Bindungstasche festgelegt werden. Durch Übertragung der Erkenntnisse aus den Untersuchungen zur Bindung von cCPE an Cld3 und Cld4 auf Cld1 und Cld5, Sequenzvergleiche der EZS2 von klassischen Claudinen sowie daran anschließende Bindungsstudien wurden je zwei Aminosäuren in der EZS2 von Cld1 (D150, T153) und Cld5 (D149, T151) identifiziert, welche die cCPE-Bindung schwächen (Cld1) bzw. verhindern (Cld5). Unter Verwendung der Interaktionsmodelle konnten nun Varianten von cCPE mit veränderter Cld-Bindungstasche designed werden, die an Cld5 binden können. Durch Substitution eines Tyrosins (Y306) zu Tryptophan wurde die Tripel-Tyr-Tasche von cCPE verkleinert. Diese Verkleinerung in Kombination mit einem, die Cld-Bindungstasche verengenden, Austausch eines Serins (S313) zu Histidin ergab eine cCPE-Variante mit nanomolarer Affinität für Cld5 bei gleichzeitig schlechterer Bindung an die klassischen CPE-Rezeptor-Claudine (Cld3, Cld4, Cld6–Cld9). Neben der Charakterisierung der cCPE-Cld-Interaktion wurde im Zuge dieser Arbeit auch ein vollständiges Modell von Cld5 anhand der von Jan Rossa experimentell ermittelten Daten in Verbindung mit evolutionären Kontakten generiert. Dieses Modell liefert erste Einblicke in die räumliche Orientierung der 4 Transmembranhelices von Claudinen zueinander und kann zur Entschlüsselung der komplexen cis\- und trans-Interaktionen der Claudine beitragen, welche eine entscheidende Rolle bei der Funktion und Organisation der “Tight Junctions” spielen. Das Hauptergebnis dieser Arbeit ist eine gezielte Veränderung des Bindungsverhaltens von cCPE, welches nativ nicht an Cld5 bindet. Durch rational gewählte Doppelsubstitutionen in cCPE (Y306W/S313H) wurde eine Bindung mit nanomolarer Affinität an Cld5 erreicht. Diese neue cCPE-Variante (cCPEY306W/S313H) bietet eine Grundlage zur Entwicklung eines Cld5-spezifischen Binders und ist ein prinzipieller Nachweis dafür, dass auf Basis von cCPE auch cCPE-Varianten mit starker Bindung an nicht-CPE-Rezeptor-Claudine generiert werden können. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit auch cCPE-Varianten mit verbesserter Spezifität für Cld3 (cCPEL223A/D225A/R227A) und Cld4 (cCPEL254A/S256A/I258A/D284A) erstellt. Somit ist es zum ersten Mal möglich, mit cCPE-Varianten bestimmte Cld-Subtypen gezielt zu binden bzw. von der Bindung auszuschließen – ein wichtiger Schritt zur Entwicklung von cCPE als TJ-Modulator, “Drug Delivery”-System oder zur Detektion bzw. Behandlung von Cld überexprimierenden Krebszellen. Darüber hinaus liefern die weiteren Ergebnisse der Arbeit detaillierte Einblicke in die molekulare Struktur und Funktionsweise der Claudine bzw. der cCPE-Claudin- Interaktion, die neue Möglichkeiten für die pharmakologische Entwicklung cCPE- oder CPE-basierender Cld-subtypspezifischer Claudin-Binder eröffnen. Das mit experimentellen Daten verifizierte vollständige Modell von Cld5 ist außerdem eine gute Grundlage für weiterführende Studien, die mittels gezielter Aminosäuresubstitutionen die Oligomerisierung und Organisation von Claudinen in “Tight Junctions” untersuchen.

Claudins are essential constituents of Tight Junctions (TJs) and responsible for maintenance of these cell-cell contacts. Binding of Clostridium perfringens Enterotoxin’s C-terminal domain (cCPE) to the extracellular loop 2 (EZS2) of claudins, especially Cld3, Cld4 and Cld6-Cld9 causes a reversible opening of TJs. Thus, a structure-function analysis of this system is relevant for biomedical application, since cCPE could be used to enhance paracellular drug uptake. Furthermore cCPE respectively CPE could be used for detection or treatment of Cld3 or Cld4 overexpressing carcinomas. Particularly a Cld5 binding cCPE-variant would be of interest to enhance the permeability of the blood-brain barrier for cytostatics in cases of brain-tumours. However, this needs reprogramming of cCPE’s specificity. Determinants of the cCPE-claudin interaction and cCPE’s specificity for certain Cld-subtyps remained unclear, since no structural information is available for claudins. Therefore, in the course of this work, detailed structural models of cCPE with the EZS2 of Cld3 and Cld4 were created by combining structural bioinformatics and methods of molecular biology in an iterative process. Subsequently, these Models were used to obtain a rational designed cCPE-variant with shifted Cld-subytyp specificity towards Cld5. Furthermore, first steps towards a usage of cCPE as a diagnostic probe to detect overexpression of certain Cld-subtypes were taken by chemical modification of cCPE with fluorophores as well as a cage compound for Xenon. In detail, utilizing cCPE’s crystal structure and the results of cellular binding studies a full mapping and characterisation of cCPE’s Cld- binding pocket was carried out and homology models of the EZS2 of Cld3 and Cld4, as well as cCPE-Cld interaction models, were created. Moreover, by directed substitution of residues in cCPE and claudins, one of the key interactions of cCPE-Cld binding was identified, and the orientation of the EZS2 in cCPE’s Cld-binding pocket was determined. L150/151 (Cld3/4) interacts with a deep and strongly hydrophobic pit within the Cld-binding pocket, which is formed by Y306, Y310 and Y312 (triple-Tyr pit). Transfer of the knowledge gained by studying cCPE’s binding to Cld3 and Cld4 to Cld1 and Cld5, sequence comparison of the EZS2 of classic claudins, as well as following binding studies, resulted in the identification of two residues each within the EZS2 of Cld1 and Cld5, which weaken (Cld1) or block (Cld5) the interaction with cCPE. Consequently, the interaction models were utilized to design cCPE- variants with a changed Cld-binding pocket, allowing binding to Cld5. By downsizing the triple-Tyr pit of cCPE with a substitution of tyrosine (Y306) to tryptophan, in combination with a substitution of serine (S313) to histidine, which narrows the Cld-binding pocket, a cCPE-variant with nanomolar affinity for Cld5 was created. This new cCPE-variant (cCPEY306W/S313H) also shows decreased binding to classic CPE-receptor claudins (Cld3, Cld4, Cld6-Cld9). Apart from characterizing the cCPE-Cld interaction, a full model of Cld5 was established. This model is based on experimental data, determined by Jan Rossa as well as evolutionary contacts. It provides first insights into the arrangement of the 4 transmembrane helices of claudins and is also useful to unravel the complex cis\- and trans-interactions of claudins, which have a crucial role in organisation and function of tight junctions. The main result of this study is that two rational chosen substitutions (Y306W/S313H) change cCPE’s binding behaviour to bind Cld5 with a nanomolar affinity. This new cCPE-Variant (cCPEY306W/S313H) provides a good basis for development of a Cld5-specific binder and is a proof of principle that cCPE can be used to design variants targeting non-CPE-re¬cep¬tor claudins. Additionally, two cCPE- variants with improved specificity for Cld3 (cCPEL223A/D225A/R227A) and Cld4 (cCPEL254A/S256A/I258A/D284A) were generated in the course of this work. Thus, it is now for the first time possible to selectively target distinct Cld- subtypes with cCPE-variants, an important step for the development of cCPE as TJ-modulator, drug delivery system or tool for detection and treatment of claudin overexpressing tumours. In sum, the results provide detailed insights into the molecular structure and function of claudins and the cCPE-claudin interaction, which on the one hand contribute to new possibilities for the pharmacological development of subtype specific Cld-binders based on CPE and cCPE. On the other hand, the experimentally verified full model of Cld5 now allows to study oligomerisation and organisation of claudins in tight junctions by targeted substitutions.