The role of Notch signaling pathway in cisplatin sensitivity and radiation sensitivity in head and neck squamous cell carcinoma

Abstract

The treatment of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) involves multimodality management, including surgery, radiotherapy and systemic chemotherapy. Cisplatin-based concurrent chemo-radiotherapy is now considered to be the standard treatment for patients with locally advanced unresectable HNSCC. However, though addition of cisplatin to radiotherapy improved outcome, the number of patients presenting with recurrences is still high, probably due to the presence of cisplatin resistant tumor cell subclones in these cases. It is imperative to develop new strategies to improve the antitumor effect of cisplatin. The results from a previous study of our group were suggestive that the Notch signalling pathway might be involved in cisplatin or radio- resistance. Tumors with Notch1 mutations were significantly more sensitive to cisplatin based chemo-radiotherapy, compared to tumors without Notch1 mutations. However, the molecular basis for the different treatment efficacy depending on the NOTCH mutational status remains unresolved. In the current project, the effect of NOTCH gene silencing on the cisplatin or radiotherapy sensitivity of HNSCC cells was therefore investigated. The human HNSCC cell lines (FaDu and UD-SCC-4) and cisplatin-resistance cell lines derived thereof (FaDu CDDP-R and UD-SCC-4 CDDP-R) were used in this project. The role of Notch1 in cisplatin resistance was studied by transfecting cells with small interfering RNA (siRNA) targeting Notch. Additionally, cancer cells were treated with γ-secretase inhibitor (GSI IX), which inhibits Notch1 activation by proteolytic cleavage. Relative viability of cancer cells was determined by the MTT assay. Notch expression in the HNSCC cell lines following transfection with siRNA was determined using real-time RT-PCR and western blot analysis. The target genes in the Notch signaling pathway (Hes1 and Hey1) were measured by real-time RT-PCR. Both full length Notch1 (F-Notch1) and activated cleaved Notch1 (C-Notch1) were found to be up-regulated in the cisplatin resistant HNSCC cell lines. However, silencing of Notch1 and Notch3 by siRNA transfection did not change the sensitivity of HNSCC cells to cisplatin (p>0.05). When cells were treated with GSI IX twenty-four hours before addition of cisplatin, the sensitivity to cisplatin was significantly decreased in these four cell lines (p<0,05). Furthermore, a significant difference of activated caspase-3 was observed between cells treated with cisplatin alone and its combination with GSI IX. Thus, the Notch1 signalling pathway seems to play a critical role in sensitivity of HNSCC cells to cisplatin. It is important to notice that GSIs might decrease tumor cell sensitivity to cisplatin as they have already been used in HNSCC patients in phase I clinical trials as chemotherapy sensitizer. Thus, the molecular basis for the unexpected reduction of cisplatin sensitivity of HNSCC cells after GSI-treatment should be further explored in future studies.

Die Behandlung von Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen (HNSCC) ist oft komplex und beinhaltet ein multimodales Management, welches die Chirurgie, Strahlentherapie und systemische Chemotherapie einschliesst. Für Patienten mit einem lokal fortgeschrittenem HNSCC kommt eine Cisplatin-basierte Chemotherapie in Kombination mit einer Strahlentherapie als Standard- Behandlung zur Anwendung. Obwohl sich die Prognose durch die Hinzunahme von Cisplatin zur Strahlentherapie verbessert hat, kommt es nach wie vor auch nach dieser intensivierten Therapie zu Rezidiven, möglicherweise durch die Anwesenheit von resistenten Tumorzell-Subpopulationen in diesen Fällen. Es ist daher unerlässlich, neue Strategien zur Verbesserung der Antitumorwirkung von Cisplatin zu entwickeln. Eine vorangegangene Studie unserer Arbeitsgruppe hat gezeigt, dass der Notch-Signalweg an Cisplatin oder Radio-Resistenz beteiligt sein könnte. Patienten mit Notch1-Mutationen reagierten signifikant empfindlicher auf eine Cisplatin-basierte Chemo-Strahlentherapie, verglichen mit Patienten ohne Notch1-Mutationen. Die genauen molekularen Ursachen für die unterschiedliche Therapiewirksamkeit in Abhängigkeit des Notch1-Mutationsstatus sind jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Wirkung der Hinunterregulation von Notch auf die Sensitivität von HNSCC-Zellen gegenüber Cisplatin oder Strahlentherapie untersucht. Die humanen HNSCC-Zelllinien FaDu und UD-SCC-4 und daraus abgeleitete Zelllinien mit Resistenz gegenüber Cisplatin (FaDu CDDP-R und UD-SCC-4 CDDP-R) wurden dafür verwendet. Zur Hemmung des Notch-Signalsweges wurden diese Zellen mit kleiner interferierender RNA (siRNA) für Notch transfiziert. Alternativ wurden die Krebszellen mit dem γ-Sekretase-Inhibitor (GSI IX) behandelt, was die Bildung von aktivem Notch-Protein hemmt. Der Einfluss der Hemmung des Notch Signalweges auf die Viabilität der Krebszellen wurde durch den MTT-Assay bestimmt. Die Notch-Expression in den HNSCC-Zelllinien wurde nach Transfektion mit siRNA unter Verwendung von Real-time-PCR und Western-Blot-Analyse gemessen. Die Expression der Zielgene im Notch-Signalweg (HES1 und HEY1) wurden ebenfalls mittels Real-time-PCR gemessen. Die Untersuchungen ergaben, dass sowohl das unprozessierte Notch1 (F-Notch1) als auch die prozessierte aktivierte Form von Notch1 (C-Notch1) in den Cisplatin-resistenten HNSCC- Zelllinien hinaufreguliert war. Die Hemmung der Expression von Notch1 und Notch3 durch siRNA-Transfektion änderte jedoch die Empfindlichkeit gegenüber Cisplatin in HNSCC-Zellen nicht (p> 0,05). Wenn Zellen 24 Stunden vor Cisplatin mit GSI IX behandelt wurden, wurde die Empfindlichkeit gegenüber Cisplatin signifikant verringert (p <0,05). Darüber hinaus wurde ein signifikanter Unterschied der aktivierten Caspase-3 zwischen Cisplatin- behandelten Zellen und Cisplatin in Kombination mit GSI-IX-behandelten Zellen beobachtet. Der Notch1 Signalweg scheint daher eine entscheidende Rolle bei der Cisplatin-Sensitivität in HNSCC-Zellen zu spielen und seine pharmakologische Hemmung mittels GSIs eine negativen Auswirkung auf die Wirksamkeit der Cisplatin-Therapie zu haben. Dieser Befund ist wichtig, da der Einsatz von GSIs zur Chemosensibiliserung bereits in klinischen Phase I Studien bei Patienten mit Kopf-Hals-Karzinom getestet wird. Eine weitere Überprüfung der Rolle der GSIs bei HNSCC sollte daher erfolgen.