Untersuchungen zum funktionellen Einfluss von Einzelnukleotidvariationen in humanen Lipoxygenasen und anderen Genen des LOX-Stoffwechsels

Abstract

Lipoxygenasen (LOXn) bilden eine heterogene Gruppe von Dioxygenasen, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren oxidieren. In epidemiologischen Studien sind eine Reihe von nicht-synonymen Einzelnukleotidvariationen (SNPs, Mutationen) in humanen LOXn mit einer Vielzahl an polygenen Erkrankungen (Asthma bronchiale, Atherosklerose etc.) assoziiert worden. Vor Beginn meiner Arbeit existierten für die meisten genetischen Variationen jedoch keinerlei funktionelle Daten, weshalb der epidemiologische Zusammenhang einen rein beschreibenden Charakter hatte. Vor diesem Hintergrund wurde zunächst eine systematische Analyse über das Vorkommen, die Verteilung und die funktionellen Effekte von nicht-synonymen genetischen Variationen in humanen LOXn und anderen Genen des LOX-Stoffwechsels durchgeführt. Es zeigt es sich, dass häufig vorkommende Variationen (SNPs) überwiegend an funktionell wenig bedeutsamen Positionen in den Primärsequenzen dieser Proteine vorkommen. Bei Enzymen, deren aktive Zentren vor allem im Inneren der Proteine vorliegen, sind diese Aminosäurereste häufig an der Oberfläche lokalisiert, was eine plausible Erklärung für ihre meist geringen funktionellen Effekte ist. Lediglich der mit einem erhöhten Risiko für die koronare Herzkrankheit assoziierte hALOX15 Thr560Met SNP (rs34210653) war entsprechend früheren Daten katalytisch inaktiv. Dabei konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass die Inaktivität dieser Mutante durch eine partielle Fehlfaltung des Enzyms verursacht wird. Ähnliches konnte auch für die zwei neu entdeckte loss- of-function Variationen, hALOX15 Gly422Glu (rs61099320) und hALOX15B Ala416Asp (rs140152561), gezeigt werden. In silico Daten deuteten dabei an, dass die Fehlfaltung von hALOX15 Gly422Glu auf eine sterische Behinderung der normalen Proteinfaltung in der Nähe zum aktiven Zentrum zurückzuführen ist. Die Datenbankanalyse deutete zudem die Existenz von weiteren funktionell relevanten Variationen (Stopmutationen, Substitution von funktionell wichtigen Aminosäuren) in verschiedenen Genen des LOX-Stoffwechsels hin. Allerdings besitzt mit Ausnahme des Thr560Met SNPs der hALOX15 keine genetische Variation eine Allelfrequenz > 1 %. Die kodierenden Bereiche der untersuchten Gene unterliegen demnach einem evolutionären Druck, welcher die Akkumulation von funktionell fehlerhaften Allelen verhindert. Dies erscheint auch deshalb plausibel, da der LOX-Stoffwechsel seit der Entstehung von Knochenfischen vor 350-400 Mio. Jahren in den Vertebraten weit verbreitet vorkommt. Dennoch scheint es vereinzelt genetische Variationen zu geben, die einen Effekt auf die Funktionalität des LOX-Stoffwechsels haben. Diese potenziell krankmachenden Mutationen (loss-of-function) sind zwar selten, sollten aber in der personalisierten Medizin große Bedeutung für die Entwicklung individueller therapeutischer Konzepte haben.

Lipoxygenases are lipid-peroxidizing enzymes that catalyze the dioxygenation of polyunsaturated fatty acids to their corresponding hydroperoxides. Non- synonymous genetic variations in human lipoxygenase genes have been associated in epidemiological studies with different polygenic diseases like Asthma bronchiale and atherosclerosis. Before we started this project most of these variations were not functionally characterized and thus, the epidemiological correlation was purely descriptive. To explore the mechanistic basis for the correlation we systematically analyzed the functional impact of selected genetic variations in human lipoxygenases and in other genes of the LOX pathway. We found that common genetic variations usually occur at functional less important amino acid positions in the primary sequences of those proteins. In enzymes with an active site localized in the centre of the protein these residues are mostly located at the protein surface, which might be a plausible reason for their minor functional effects. However, some genetic variations such as the hALOX15 Thr560Met SNP (rs34210653; allele frequency 1,5 %), which was associated with a higher risk for coronary artery disease, were catalytically inactive. We found that the catalytic silence is due to severe misfolding of the enzyme. Similar observations were made for the two newly discovered loss-of-function mutations in human LOX genes: hALOX15 Gly422Glu (rs61099320) and hALOX15B Ala416Asp (rs140152561). Structural modeling indicated that the substitution of the Gly422 with bulkier amino acids causes sterical clash with surrounding residues. Database analysis suggests that there are additional functionally relevant non-synonymous genetic variations (nonsense, substitution of functional important amino acid residues) in many genes of the LOX pathway but except for the hALOX15 Thr560Met SNP neither of them has an allele frequency > 1%. One may conclude that there is evolutionary pressure on these enzymes and receptors, which prevents accumulation of functional inactive alleles within the human population. This conclusion is somehow plausible since LOX products are biologically relevant and the LOX pathway, which was introduced during evolution of life at 350-400 Mill years ago when bony fish appeared, has been highly conserved in vertebrates since then. Nevertheless there are some genetic variations, which might impact the lipoxygenase pathway. These rare, disease-related mutations (loss-of-function) will play an important role in the personalized medicine for the development of optimized therapeutically concepts.