"Angioprotektin": ein vasoprotektives Angiotensin-Peptid

Abstract

Die Gruppe der Angiotensin-Peptide erweiterte sich im Laufe der letzten Jahre zunehmend. In den meisten Fällen verfügen die jeweiligen Abkömmlinge des Angiotensin-II (Ang-II) dabei über unterschiedliche Affinitäten gegenüber den bekannten Angiotensin-Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit wurde das Oktapeptid Pro-Glu-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (Angioprotektin), ein endogener Gegenspieler gegenüber den Ang-II-induzierten Effekten am AT1-Rezeptor, aus menschlichem Blutplasma isoliert, mittels MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie identifiziert und nachfolgend in seiner physiologischen Wirksamkeit charakterisiert. Zur Fraktionierung des Plasmas kamen zu Beginn zwei chromatographische Auftrennungsmethoden zum Einsatz, die Größenausschluss- Chromatographie und die Reversed-Phase-Chromatographie. Nachdem wir auf diesem Wege das unbekannte Peptid in einer homogenen Fraktion isoliert hatten, erfolgte die massenspektrometrische Untersuchung mittels MALDI-TOF-MS. Es zeigte sich hierbei eine molekulare Masse des Peptids von 1001,5 Da. Das zugrundeliegende Peptid wurde mittels MS-MS-TOF-TOF fragmentiert, um weitere Information über dessen Aufbau zu erhalten. Nachdem sich durch einen Datenabgleich unseres Fragmentspektrums mit der MS/MS-Datenbank Mascot (www.matrixscience.com) keine Aussagen über die gesuchte Aminosäuresequenz des Peptids erzielen ließ, erfolgte zur weiteren Identifikation eine de-novo- Sequenzierung, die die Aminosäuresequenz „Pro-Glu-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe“ ergab, im Folgenden „Angioprotektin“ genannt. Das Ergebnis wurde bestätigt, indem das Fragmentspektrum unseres Peptids mit dem des synthetisch hergestellten Peptids mit der entsprechenden Aminosäuresequenz verglichen wurde. Das Angioprotektin verfügt in physiologisch relevanten Konzentrationen über keinen direkten vasokonstriktorischen Effekt bei isolierten Aortenringen der Ratte, jedoch interagiert es mit den vasokonstriktorischen Effekten des Ang-II. In physiologischen Charakterisierungsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass eine äquivalente Dosis des Angioprotektins eine Ang-II-induzierte Vasokonstriktion um etwa 30 % reduziert. Insofern kann dem Angioprotektin unter in-vivo-Bedingungen ein vasodilatativer Effekt zugeschrieben werden. Das Angioprotektin interagiert mit den vasokonstriktorischen Effekten des Ang-II über eine Stimulation des MAS-Rezeptors, welcher sowohl den intrazellulären Kalziumeinstrom als auch die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthese moduliert. Insgesamt besteht in seiner Wirksamkeit eine Homologie zum Angiotensin-(1-7), einem bekannten Agonisten des MAS-Rezeptors. Die Angioprotektin-Plasmakonzentrationen lagen bei gesunden Probanden in einer Größenordnung von etwa 15% gegenüber den Ang-II-Plasmakonzentrationen, bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz dagegen bei etwa 50%. Diese Plasmakonzentrationen liegen hinsichtlich der beobachteten Wirkungen innerhalb durchgeführter Bioassays zur physiologischen Wirksamkeit im relevanten Bereich. Die Plasmakonzentrationen des Angioprotektins waren in der Gruppe der niereninsuffizienten Patienten gegenüber der Gruppe der gesunden Probanden um das 3,12-fache erhöht. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, ob das Angioprotektin möglicherweise die Voraussetzungen für einen neuartigen Biomarker zur Früherkennung der chronischen Niereninsuffizienz erfüllt. Ein kommerziell erhältlicher Ang-II-Quantifizierungsassay zeigte eine Kreuzreaktivität zwischen Angioprotektin und Ang-II und konnte dadurch zwischen beiden Molekülen nicht diskriminieren. Aus diesem Grund sollten Antikörper-basierte Assays mit Vorsicht interpretiert werden, besonders, wenn sich die Ang-II- und Angioprotektin-Werte in einem ähnlichen Bereich befinden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der endogene Ang-II-Gegenspieler Angioprotektin physiologische und pathophysiologische Ang-II-Effekte beeinflusst und dadurch einen potentiell wichtigen neuen Modulator des Renin- Angiotensin-Systems repräsentiert.

The family of angiotensin peptides has been steadily growing over the last decades. Mostly, new analogues of angiotensin II (Ang-II) showed different affinities to the known angiotensin receptors. In this work an endogenous peptidic counterpart of Ang-II actions on the AT1 receptor, the octapeptide Pro-Glu-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (Angioprotectin) was isolated from human plasma, consecutively identified by MALDI-TOF-TOF mass spectrometry and eventually characterised in terms of its physiological effects. First, in order to fractionate the plasma we used a combination of size-exclusion chromatography and reversed-phase chromatography. The reversed-phase chromatography on the one hand allows desalting the eluate of the size- exclusion chromatography and on the other hand fractionating the eluate. After we had obtained the peptide in a homogenous fraction we performed MALDI-TOF- TOF mass spectrometry. According to these techniques, the peptide displays a molecular mass of 1001.5 Da. The underlying peptide was fragmented by MS-MS- TOF-TOF-mass spectrometry to obtain sequence information. Since no match from the MS/MS database Mascot (www.matrixscience.com) search was retrieved, we used for identification de novo sequencing, which led to the amino-acid sequence Pro-Glu-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe, henceforth-named “Angioprotectin”. This result was confirmed by comparison to a fragment ion spectrum of the identical synthetic peptide. Angioprotectin has no direct vasoconstrictive or vasodilative effect on rat aortic tone in physiologically relevant concentrations. However, Angioprotectin counteracts the vasoconstrictive Ang- II actions on rat aortic rings. Equivalent Angioprotectin concentrations reduced Ang-II-induced vasoconstrictions by about 30 %. Therefore, it may be considered a vasodilatory peptide under in-vivo conditions. Angioprotectin counteracts the vasoconstrictive Ang-II actions by receptor MAS stimulation, which modulates both Ca2+ influx and NO release. Human plasma concentrations in healthy volunteers were about 15 % and in renal failure patients up to 50 % that of Ang-II plasma concentrations. These plasma concentrations are sufficient to modulate Ang-II actions as measured within the experimental bioassays. Angioprotectin plasma concentrations are increased 3.12-fold in end-stage renal failure patients compared to healthy controls. These findings provide the basis for further investigation, whether Angioprotectin complies with the requirements of a novel and valid biomarker for the early detection of chronic kidney failure. A commercially available Ang-II antibody did not discriminate Angioprotectin from Ang-II. The endogenous AT1 counterpart Angioprotectin contributed to the quantitative result of Ang-II concentrations measured by antibody-based assays. Therefore, antibody-based Ang-II assays should be interpreted with caution, especially when Ang-II and Angioprotectin levels are in the same range. In conclusion, the endogenous AT-1 counterpart Angioprotectin modulates physiological and pathological Ang-II actions, thus representing a potentially important new modulator of the human renin angiotensin system.