Topische Applikation von Opioiden: Einfluss auf die Wundheilung und Untersuchung möglicher Trägersysteme

Abstract

Bei schweren und schwersten Schmerzen durch Verletzungen der Haut, einerseits nach Verbrennungen und Hauttransplantationen, andererseits auch bei chronischen Wunden wie dem Ulcus cruris erfordert eine erfolgreiche Schmerzbehandlung heutzutage die systemische Applikation von hochwirksamen Opioiden. Damit verbunden ist jedoch häufig eine hohe Rate an unangenehmen (Obstipation) und teils sogar lebensgefährlichen Nebenwirkungen wie Atemdepression, weshalb eine lokale Anwendung dieser Stoffe bei Schmerzen in der Peripherie in Betracht gezogen werden muss. Wichtig dabei ist jedoch, dass der Wundheilungsprozess nicht beeinträchtigt, im besten Falle sogar gefördert wird. Um eine langfristige und gleichmäßige Substanzfreisetzung und damit einen möglichst späten Verbandwechsel von Hautwunden ohne zusätzliche systemische Opioiddosen zu ermöglichen, wird der Einsatz von Opioid-beladenen Nanopartikeln in Betracht gezogen. Deswegen war es auch Ziel der Arbeit, den Einfluss von zwei in Frage kommenden Partikelsystemen auf die Wundheilung zu klären. Es ist zunächst gelungen, den Einfluss von Opioiden auf die für die Wundheilung bedeutende Keratinozytenmigration zu erschließen. Diese Untersuchungen erfolgten dabei mit der Keratinozytenzelllinie HaCaT. Alle Opioide (Morphin, Hydromorphon, Fentanyl, Buprenorphin) stimulierten die Keratinozytenmigration konzentrationsabhängig, der Effekt wurde durch den spezifischen Opioidrezeptorblocker Naloxon aufgehoben. Migrationsförderung konnte aber auch bei leicht sauren Bedingungen erzielt werden, was auf eine Anwendbarkeit der Opioide im entzündeten Milieu hindeutet. Zudem wurde nachgewiesen, dass diese Opioidwirkung zumindest im 5-stündigen Versuch auf rein chemotaktischen Eigenschaften der Opioide beruht. Einzig Buprenorphin als partieller Agonist hatte hier durch seine zusätzlich chemokinetische Wirkung eine Sonderstellung. Bei Verwendung der vier verschiedenen Substanzen zeigten sich am 2D-Modell kaum Unterschiede hinsichtlich der Wirkstärke der einzelnen Stoffe, weshalb die Begrenzung auf Morphin, stellvertretend für die Klasse der Opioide, bei weiterführenden aufwendigen Wundheilungsuntersuchungen gerechtfertigt erschien. Die Migrationsförderung als Ergebnis des Migrationsassays konnte in einem weiteren 2D-Versuch, dem Scratch-Test bestätigt werden. Im Migrationsassay wurde außerdem die Eignung zweier in Frage kommender Trägersysteme (SLN und CMS Nanotransporter) geklärt, wobei sich zeigte, dass unbeladene CMS Nanotransporter die Keratinozytenmigration nicht stören, unbeladene SLN sie sogar fördern können. Es fand offensichtlich eine Interaktion zwischen unbeladenen SLN bzw. CMS Nanotransportern und Morphin statt. Auch die Ergebnisse der Parelektrischen Spektroskopie konnten diese Vermutung bestätigen. Um die in 2D-Zellversuchen erhaltenen Ergebnisse in einem dreidimensionalen Hautmodell zu überprüfen, wurde ein Wundheilungstest mit rekonstruierter Vollhaut (3D-Modell) etabliert, bei dem der Einfluss von Substanzen auf die Reepithelialisierung einer standardisierten Wunde verfolgt werden kann. Die Wunde wurde dabei mittels eines CO2-Lasers induziert, der Grad der Heilung mittels HE-gefärbten Gewebeschnitten histologisch untersucht. Der gebildete Keratinozytensaum auf dem Wundgrund war vier Tage nach der Verletzung deutlich besser ausgeprägt, wenn während der Heilungsperiode eine Benetzung mit einer Morphinlösung stattfand. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Auftragen von unbeladenen SLN auf die Wunde erhalten. Zudem zeigten auch erste Versuche mit Morphin-beladenen SLN eine deutlich verbesserte Wundheilung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Da nachgewiesen ist, dass die Produktion von Stickstoffmonoxid eine wichtige Rolle beim Wundheilungsprozess spielt, wurde ferner der Einfluss von Morphin auf die NO-Produktion von HaCaT Zellen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Zellen nach Morphinstimulation signifikant mehr NO ins Zellmedium abgaben als unstimuliert. Mittels quantitativer real-time PCR konnte allerdings kein Einfluss von Morphin auf die Expressionsmuster von NO- Synthasen verzeichnet werden. Ebenso konnte die Hypothese der Modifizierung der Expression dreier bei der Wundheilung involvierter Matrix- Metalloproteinasen (MMP-1, MMP-2, MMP-9) durch real-time PCR nicht bestätigt werden. Zellviabilitätsuntersuchungen zeigten, dass nach einer Verletzung bei Aufbringen von Morphin direkt auf die Keratinozyten keine zellschädigenden Auswirkungen zu befürchten sind. Selbst bei der höchsten verwendeten Morphinkonzentration nahm der Anteil an lebenden Zellen kaum ab, weshalb die topische Applikation von Morphin als unbedenklich für die Keratinozyten eingestuft werden kann. Im Hinblick auf weitere Untersuchungen zur Penetration und Permeation von Morphin bei gesunder sowie bei verletzter Haut war es ein weiteres Ziel der Arbeit, eine HPLC-Methode zur Detektion und Quantifizierung von Morphin und seinen beiden Metaboliten Morphin-3- und Morphin-6-Glucuronid zu etablieren. Auf der Grundlage einer bereits veröffentlichten Methode ist es gelungen, eine Gradientenmethode mit anschließender UV-Detektion zu entwickeln. Es konnten gut reproduzierbare und getrennte Peaks für die drei Einzelsubstanzen sowie den internen Standard Codein erzeugt werden. Die Prävalidierung der Methode wurde erfolgreich abgeschlossen.

Treatment of severe pain due to skin wounds, resulting either from burns or after skin grafting as well as pain as a result from chronic wounds, asks for the systemic administration of potent opioids. This often implies a high incidence of unwanted side effects like constipation or even severe ones like respiratory depression. Therefore, for treatment of peripheral pain, a local administration of opioids has to be considered. Hereby an interference with the wound healing process has to be excluded, at the best it can even be improved. A long lasting and consistent drug release from opioid-loaded nanoparticles can enable a delayed change of wound dressing without the need of additional systemic opioids. The change of wound dressings is strongly painful for the patient. Therefore the aim of this study was to elucidate the influence of opioids as well as two different types of nanoparticles on the wound healing process. First, the influence of different opioids on the migration of keratinocytes as an important event of wound healing was investigated using the keratinocyte cell line HaCaT. All opioids tested (morphine, hydromorphone, fentanyl and buprenorphine) stimulated keratinocyte migration in a concentration dependant manner, effects could be blocked by the opioid receptor antagonist naloxone. Induction of migration was also achieved using acidified environment, suggesting applicability even in inflamed wound areas. Furthermore it was shown that opioid action is based only on a chemotactic ability in the 5 h experiments. Only buprenorphine showed additional chemokinetic action, possibly due to its quality as a partial antagonist. Since morphine, hydromorphone, fentanyl and buprenorphine did not differ in their potency to a relevant extent, morphine was used as a representative for further investigations concerning wound healing. In the scratch assay, a second test system for 2D migration, the results from the migration assay were confirmed. Additionaly, two different carriers (SLN and CMS nanotransporters) were investigated for their potential as possible delivery systems. Unloaded CMS nanotransporters did not interfere with keratinocyte migration, unloaded SLN even induced it. Obviously unloaded SLN and CMS nanotransporters interacted with morphine. Results obtained from parelectric spectroscopy confirmed this hypothesis. A third wound healing test system using reconstructed human full thickness skin (3D model) was established to proove the results obtained from the 2D assays. Herein the influence of different substances on the reepithelialization of a standardized wound was followed histologically. Wound induction was achieved using a CO2-laser, wound healing was investigated by the morphology of HE-stained tissue sections showing reepithelialization of the wound by newly formed keratinocytes. 4 days after wounding the margin of keratinocytes was considerably thicker when wounds were supplied with morphine-containing solution during the healing period. Similar results were obtained when applying unloaded SLN onto the wounds. Furthermore, morphine-loaded SLN also showed improved wound healing in comparison to the untreated control. It has been shown that production of nitric oxide plays an important role during wound healing. Therefore the influence of morphine on the production of nitric oxide by HaCaT cells has been investigated, too. Cells stimulated with morphine produced significantly more nitric oxide than unstimulated cells. Using real-time PCR, however, no influence of morphine on the expression of NO-synthases could be confirmed. Similarly, no alterations in the expression patterns of 3 different matrix-metalloproteinases (MMP-1, MMP-2, MMP-9) involved in wound healing could be displayed. MTT assays showed that exposure of keratinocytes in wounded skin to morphine will not affect their viability. Even with the highest concentration used, no decrease in the number of viable cells was seen, indicating a topical administration of morphine onto keratinocytes to be safe. With regard to further investigations concerning penetration and permeation of morphine into healthy and wounded skin, the establishment of an HPLC method to detect and quantify morphine and its two major metabolites morphine-3- and morphine-6-glucuronide was a further aim. Based on a published method, a new method using a gradient of two solvents followed by an UV-detection was developed. The 3 substances and the internal standard codein were seperated well and the method appeared to display good reproducibility. Prevalidation of the method was achieved successfully.