Interaktion zwischen Tendozyten und aus dem peripheren Blut stammenden autologen Leukozyten vor dem Hintergrund der Sehnenheilung

Abstract

Der Einfluss von pro-inflammatorischen Zytokinen sowie anderen katabolen Mediatoren, die von Leukozyten freigesetzt werden und auf die Tendozyten während der Sehnenheilung und bei der Bildung von Narbengewebe einwirken, ist weitestgehend unbekannt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein indirektes Ko-Kultur-System verwendet, um den Effekt von autologen Leukozyten auf die Genexpression der Tendozyten im Hinblick auf pro-inflammatorische Zytokine und Matrixkomponenten zu untersuchen. Lapine Tendozyten von New Zealand White Rabbits wurden isoliert und in vitro expandiert. Aus dem peripheren Blut derselben Spendertiere wurden autologe Leukozyten (peripheral blood mononuclear cells [PBMCs]) und neutrophile Granulozyten isoliert und mit den Tendozyten in einem Transwell-System ko-kultiviert. Einige Kulturen wurden zusätzlich mit TNFα behandelt. Nach einer Stimulationsdauer von 24 h wurden die ECM-Komponenten (Kollagen Typ I, Decorin und Fibronektin), der Zell-ECM Rezeptor β1-Integrin, der pro-angiogenetische Faktor Myodulin, die ECM degradierende Matrix-Metalloproteinase (MMP) 1 und die pro-inflammatorischen Zytokine Tumor-Nekrose-Faktor α (TNFα), Interleukin IL-1β und IL-6 mit Hilfe der RTD-PCR und z.T. mittels Western Blot analysiert. Ferner wurden Caspase-3/7 Aktivitäten bestimmt und ein TUNEL-Assay durchgeführt. Der einzige signifikante Effekt der Leukozyten im Hinblick auf die Genexpression der untersuchten ECM-Komponenten bestand in der Suppression von Kollagen Typ I durch neutrophile Granulozyten, kombiniert mit TNFα. Der gleiche Effekt konnte auch bei der Analyse der Genexpression von β1-Integrin und Myodulin festgestellt werden. PBMCs haben die Genexpression der Zytokine und MMP1 signifikant hochreguliert. Im Western Blot konnten keine signifikanten Effekte der Ko-Kultivierung für das β1-Integrin und die MMP1 ermittelt werden. Obwohl im TUNEL-Assay eine vermehrte DNA Fragmentation bei den Tendozyten die mit PBMCs stimuliert wurden erkennbar war, konnte in keiner der Ko-Kulturen eine signifikant veränderte Caspase-Aktivität beobachtet werden. Die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen lassen vermuten, dass PBMCs als exogener Stimulus für die Induktion von pro-inflammatorischen und katabolen Mediatoren im Sehnengewebe wirken könnten.

Pro-inflammatory cytokines and other catabolic mediators could be involved in tendon healing and contribute to scar formation, whereby their impact on tenocytes is still mostly unclear. Leukocytes are probably a source for exogenic cytokines in ruptured tendon. Hence, an indirect co-culture system was used to test the effect of autologous leukocytes derived soluble mediators on tenocytes gene expression. Rabbit derived primary tenocytes were isolated from New Zealand White Rabbits Achilles tendons and expanded in vitro. From the whole blood of the same animals, autologous leukocytes (peripheral blood mononuclear cells [PBMCs] and neutrophils) were isolated and co-cultured with the tenocytes using a two chamber system. Subsequently, tenocytes gene expression of tendon extracellular matrix proteins (ECM) components (type I collagen, decorin, ß1-integrin and myodulin), matrix degrading matrix- metalloproteinase (MMP)-1 and cytokines (tumor necrosis factor [TNFα], interleukin [IL]-1β and IL-6) was analysed using RTD-PCR. MMP-1 and the ECM receptor β1-integrin were demonstrated by western blot analysis. Leukocytes had no significant effect on the investigated ECM genes in tenocytes, but PBMCs significantly up-regulated tenocytes gene expression of MMP-1 and proinflammatory cytokines. Tenocytes MMP-1 synthesis increased also in response to PBMCs. When tenocytes were co-cultured with neutrophils or TNFα, stimulatory effects on tenocytes did not achieve statistical significance. The influence of tenocyte/leukocyte co-culturing on β1-integrins remained not significant. These in vitro results suggest that PBMCs could present an exogenic stimulus for the induction of pro-inflammatory and catabolic mediators in tendon. Further experiments including also direct co-culturing techniques, might help to characterize aspects of early tendon healing.