Role of the oligodendrocytic connexin47 in CNS myelination

Abstract

Cx32 and Cx47 are the major gap junction proteins expressed by oligodendrocytes, the myelinating cells in the CNS. In addition to their role in cell communication, the expression of these proteins is essential for the formation and maintenance of myelin since mutations results in severe myelin related disorders. According to previously published ultra structural studies, oligodendrocytes in white matter exhibit gap junctions with astrocytes, but not among each other, while in cell culture experiments oligodendrocytes form functional gap junctions. In order to understand the basis of the myelin related diseases caused by mutations in oligodendrocytic connexins is necessary to determine which connexin form functional gap junction channels in the CNS white matter. Therefore functional coupling among oligodendrocytes and astrocytes in the corpus callosum from wildtype and different connexin- deficient mouse lines has been investigated. In addition, the impact of Cx47 mutants associated to the human leukodistrophy Paelizeus-Merzbacher-like- disease (PMLD) was studied using mice carrying the Cx47M282T point mutation (Cx47M282T/M282T). Using the patch-clamp technique the gap-junction-permeable tracer biocytin was injected into single oligodendrocytes in acute slices of corpus callosum (postnatal day 10-15). The coupled cells in the network were identified combining biocytin labeling with immunostaining for specific glial cell markers. On average 61 cells were positive for the tracer detected by biocytin labeling with fluorochrome-conjugated streptavidin. The majority of coupled cells were positive for the oligodendrocyte marker CNPase, while only 9% expressed the astrocyte marker GFAP. A small population of cells within the network expressed NG2 and Olig2, markers for oligodendrocyte precursors. Oligodendrocytes are known to express Cx47, Cx32 and Cx29, astrocytes Cx43 and Cx30. In Cx47-deficient mice, the number of coupled cells was reduced by 80%. Deletion of Cx32 or Cx29 alone did not significantly reduce the number of coupled cells, but coupling was completely absent in Cx47/Cx32-double- deficient mice. Cx47-ablation completely abolished coupling of oligodendrocytes to astrocytes. Lack of the astrocytic Cx43 resulted in a reduction of the oligodendocytic network and in the complete loss of oligodendrocyte precursors coupling, althought astrocytic coupling was still present. Animals double-deficient for the astrocytic Cx43 and Cx30 showed a significant reduction in the number of coupled cells accompanied by loss of oligodendrocyte-to-astrocyte coupling. Also in this strain coupling to oligodendrocyte precursors was never observed. Additionally uncoupled oligodendrocytes could be distinguished from the coupled one by their higher input resistance. Dye transfer experiments in mice Cx47M282T/M282T revealed that the mutated Cx47M282T causes a loss of function in situ, since inter- oligodendrocytic as well as oligodendrocytic-astrocytic coupling is significantly diminished, similarly to the reduction of gap junctional communication observed in Cx47-deficient mice. In addition homozygous Cx47M282T do not affect Cx32 proper function. With these approaches the present work clearly demonstrates that oligodendrocytes in white matter directly couple to each other depending on Cx47 and Cx32 expression. In contrast, oligodendrocyte-to-astrocyte coupling is minor, but necessary to extend the oligodendrocytic syncytium. In addition a smaller population of glial precursor cells belongs to the network. Altogether this study shows for the first time that oligodendrocytes form a syncytium among each other in situ indicating that the establishment of this network has an impact on myelination.

In Oligodendrozyten, den Myelin bildenden Gliazellen des ZNS, stellen Cx32 und Cx47 die wichtigsten Vertreter der Connexine dar. Connexine besitzen als molekulare Einheit der Gap Junctions neben ihrer Bedeutung für Zell-Zell- Kommunikation eine essenzielle Rolle für die Ausbildung und Erhaltung der Myelinscheide, denn Mutationen in Connexin Genen beim Menschen führen zu schwerwiegenden Myelin assoziierten Krankheiten.. Elektronenmikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass Oligodendrozyten der weissen Substanz Gap Junctions nur mit Astrozyten ausbilden, nicht aber mit anderen Oligodendrozyten. Oligodendrozyten in Kultur hingegen bilden untereinander Gap Junctions aus. Für ein besseres molekulares Verständnis der auf Connexin- Mutationen beruhenden Krankheiten ist es von Bedeutung zu wissen, welche Connexin Typen innerhalb der weißen Substanz funktionelle Gap Junctions ausbilden können. In dieser Arbeit wurde daher die funktionelle Kopplung zwischen Oligodendrozyten und Astrozyten im Corpus Callosum verschiedener Connexin-defizienter Mauslinien bzw. deren Wildtypen untersucht. Desweiteren soll die Bedeutung der Cx47M282T Punktmutation auf die Ausbildung funktioneller Netzwerke zwischen Oligodendrozyten erforscht werden. Die Mauslinie Cx47M282T/M282T stellt ein Modell zur Untersuchung der beim Menschen auftretenden Leukodystrophie Paelizeus-Merzbacher-like-disease (PMLD) dar. Mithilfe der Patch-Clamp Technik wurden Oligodendrozyten in akuten Hirnschnittpräparaten des Corpus Callosums 10-15 Tage alter Mäuse mit dem Gap- Junction permeablen Indikatorfarbstoff Biocytin gefüllt. Zur Darstellung der gekoppelten Zellen wurde eine immunhistochemische Färbung des Indikatorfarbstoffes Biocytin mit Fluorchrom-konjugierten Streptavidin mit spezifischen Färbungen für Gliazellen kombiniert (CNPase zur Darstellung von Oligodendrozyten, GFAP zur Darstellung von Astrozyten). Die durch Biocytin markierten Netzwerke bestanden im Mittel aus 61 gekoppelten Zellen, wovon 77% den Oligodendrozytenmarker CNPase exprimierten, 9% GFAP-positiv waren und 14% weder CNPase noch GFAP exprimierten. Ca. 50 % der Zellen aus der zuletzt genannten Gruppe exprimierten Olig2, einige wenige waren positiv für NG2, beides Marker für Oligodendrozyten-Vorläufer. Es ist bekannt, dass Oligodendrozyten Cx47, Cx32 und Cx29, Astrozyten hingegen die Connexine Cx43 undCx30 exprimieren In Cx47-defizienten Mäusen war die Anzahl der gekoppelten Zellen um 80% reduziert. Während die Deletion von Cx32 oder Cx29 nicht zu einer messbaren Reduktion der gekoppelten Zellen führte, war die Kopplung der Zellen in Cx47/Cx32-doppelt defizienten Mäusen vollständig aufgehoben. In Cx47-defizienten Tieren war die Kopplung zwischen Astrozyten und Oligodendrozyten komplett aufgehoben. Das Fehlen des astrozytären Cx43 führte zu einer Reduktion der Oligodendrozyten-Kopplung und zu einem kompletten Verlust der Kopplung innerhalb der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, wogegen die Kopplung der Astrozyten nicht beeinträchtigt war. In Tieren, denen sowohl astrozytäres Cx43 und Cx30 fehlte, war die Anzahl der gekoppelten Zellen deutlich reduziert und die Kopplung zwischen Oligodendrozyten und Astrozyten komplett aufgehoben. In dieser Mauslinie wurde auch niemals eine Kopplung zwischen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen beobachtet. Desweiteren ließen sich (bei dieser Mauslinie) ungekoppelte von gekoppelten Oligodendrozyen anhand ihres höheren elektrischen Eingangswiderstandes unterscheiden. Mithilfe von Dye-Transfer Experimenten an Cx47M282T/M282T Mäusen konnte gezeigt werden, dass die CxM282T Mutation zu einem Funktionsverlust in situ führt, denn in diesem Modell war sowohl die Kopplung zwischen Oligodendrozyten als auch zwischen Oligodendrozyten und Astrozyten deutlich verringert, und somit vergleichbar mit den an den Cx47-defizienten Mäusen gefunden Ergebnissen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Oligodendrozyten der weißen Substanz direkt untereinander gekoppelt sind, und diese Kopplung von der Expression des Cx47 und Cx32 abhängt. Im Gegensatz dazu ist die Kopplung zwischen Astrozyten und Oligodendrozyten wesentlich schwächer ausgeprägt, aber wiederum notwendig für die Ausbildung des Syncytiums aus Oligodendrozyten. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass auch eine kleinere Population von Vorläuferzellen ist in das Netzwerk eingebunden ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zum ersten mal, dass die Olgodendrozyten untereinander ein funktionelles Netzwerk ausbilden können und dass dieses von Bedeutung für die Myelinisierung ist.