Characterisation of the MID1/alpha4 multiprotein complex

Abstract

Mutations in the MID1 gene cause Opitz BBB/G syndrome (OS), a congenital disorder characterised by malformations of the ventral midline, with hypertelorism and hypospadias being the two cardinal phenotypic manifestations. The RBCC protein MID1 has been shown to form macromolecular complexes, the components of which were, up to now, mainly unknown. We could show that microtubule-associated MID1 binds alpha4, a regulatory subunit of the mTOR target phosphatase 2A (PP2A), through the Bbox1 domain, thereby targeting the catalytic subunit of microtubule-associated PP2A (PP2Ac) towards ubiquitin-specific modification and degradation. In this thesis basic functions of the Bboxes, with respect to MID1-alpha4 and MID1-microtubule interaction, were studied by immunofluorescence, immmunoprecipitation and yeast two-hybrid experiments, leading to the identification of a novel pathomechanism for OS based on mutations in the Bbox domains of MID1. While Bbox1 was shown to be responsible for the interaction of MID1 with alpha4, Bbox2 was demonstrated to act as a regulatory arm that couples the MID1 ubiquitin ligase function to the microtubules by regulating the association of MID1 with both alpha4 and the microtubules. As the main focus of this thesis, the MID1 multiprotein complex was elucidated via affinity chromatography and mass spectrometry. Apart form associating with tubulin, MID1 was shown to associate with several proteins of the small subunit (S3, S8, p40) and other multifunctional proteins such as NPM, ANXA2, and RACK1, which also associate with ribosomes and RNA, and with several heat shock proteins. Subsequently, it was shown that the MID1/alpha4 complex forms a microtubule-associated mRNP that contains active polyribosomes and RNA. In particular, it was found that it integrates mRNAs of ephrin-B ligands and receptors through G-quartet structures located in their 3´UTRs. Interaction of the MID1/alpha4 complex with the mRNA of ephrin-B1 (EFNB1) is of particular interest since mutated EFNB1 causes craniofrontonasal dysplasia, a monogenic disorder with manifestations highly reminiscent of the OS phenotype. These results suggest that the MID1/alpha4 complex probably participates in mRNA transport, providing the cell with asymmetric mRNA localisation and translation, important prerequisites for proper neural crest cell migration and epithelial- mesenchymal transition, both essential processes during ventral midline development. In addition, since ephrins and Eph-receptors are also required for a correct development of the ventral midline, it is tempting to postulate a central role for the MID1/alpha4 complex in the compartmentalised translation of these molecules at the microtubules, and especially of EFNB1. In summary, this thesis not only provides a novel mechanism for the compartmentalised control of protein production, but also offers a molecular basis for the development of OS and related disorders, which would explain the conspicuous phenotypic overlap of OS and craniofrontonasal dysplasia.

Mutationen im MID1-Gen führen zu Opitz BBB/G Syndrom (OS), eine Erbkrankheit, die durch Fehlbildungen der ventralen Mittellinie, insbesondere Hypertelorismus und Hypospadie, charakterisiert ist. Das RBCC MID1-Protein bildet makromolekulare Komplexe, deren Komponenten zu Beginn dieser Arbeit weitestgehend unbekannt waren. Wir konnten vor kurzem zeigen, dass das Mikrotubulus-assoziierte MID1-Protein mit seiner Bbox1 an das alpha4-Protein, einer regulatorischen Untereinheit der mTOR Ziel-Protein Phosphatase 2A (PP2A), bindet. Dies führt zur Übertragung von Ubiquitin auf die katalytische Untereinheit der Mikrotubulus-assoziierten PP2A (PP2Ac) und zu deren Aufbau im Proteasom. Im Rahmen dieser Arbeit wurden grundsätzliche Funktionen von den Bboxen im Zusammenhang mit MID1-alpha4 und MID1-Mikrotubuli-Interaktionen untersucht. Durch Immunfluoreszenz-, Immunprecipitation- und Yeast-Two-Hybrid- Experimente konnte ein neuer Pathomechanismus für OS nachgewiesen werden. Während sich die Bbox1 für die Interaktion zwischen MID1 und alpha4 verantwortlich zeigte, ist die Bbox2 an der Regulierung der Assoziation von MID1 mit alpha4 und den Mikrotubuli beteiligt. Als Hauptanliegen dieser Arbeit wurde der MID1-Multiprotein-Komplex mit Hilfe von Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie identifiziert und analysiert. Neben der bekannten Assoziation mit Tubulin konnte gezeigt werden, dass MID1 auch verschiedene Proteine der kleinen ribosomalen Untereinheit (S3, S8, p40), andere multifunktionale Proteine wie NPM, RACK1 und ANXA2, welche ebenfalls mit Ribosomen und RNS assoziieren, und verschiedene Hitzeschock-Proteine bindet. Durch weitere Charakterisierung des MID1-Protein-Komplexes, konnte gezeigt werden, dass der MID1/alpha4-Komplex ein Mikrotubulus-assoziiertes mRNP bildet, welches aktive Polyribosome und RNS enthält. Insbesondere wurde gezeigt, dass der MID1/alpha4-Komplex an G-Quartet-Strukturen in den 3´UTR von Ephrin-B Molekülen (Liganden und Rezeptoren) bindet. Die Interaktion des MID1/alpha4 Komplexes mit mRNS des Ephrin-B1 (EFNB1) ist besonders interessant, da mutiertes EFNB1 zu craniofrontonasaler Dysplasie führt, einer monogenen Störung, die einen sehr ähnlichen Phänotypen ausbildet wie OS. Diese Ergebnisse zeigen, dass der MID1/alpha4-Komplex wahrscheinlich den Transport der mRNS reguliert, was zu asymmetrischer mRNS Lokalisierung und Translation, wichtige Voraussetzungen für die Migration der Zellen der Neuralleiste und Epithelial-Mesenchymale-Transition, zwei essenzielle Prozesse bei der Entwicklung der ventralen Mittellinie, führt. Ephrine werden auch für die richtige Entwicklung der ventralen Mittelinie benötigt. Dies weist darauf hin, dass der MID1/alpha4-Komplex die asymmetrische Translation dieser Moleküle, insbesondere EFNB1, in Subkompartimenten der Zelle steuert. Daher bereiten die Ergebnisse dieser Arbeit eine molekulare Basis der Entwicklung der ventralen Mittellinie sowie der Pathogenese von OS, und liefern eine attraktive Erklärung für die offensichtliche phänotypische Übereinstimmung der zwei Krankheiten.