Generierung und Charakterisierung neuer transgener Mausmodelle zur Untersuchung der Neuron-Glia-Interaktion

Abstract

Welche Rolle spielen Neuron-Glia-Interaktionen bei der Informationsprozessierung, beim Lernen und Gedächtnis im Gehirn? Viele wichtige Fragen im Bereich der Neuron-Glia-Interaktion können mit Hilfe der im Rahmen dieser Arbeit generierten und charakterisierten Mauslinien beantwortet werden. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass verschiedene fluoreszente Proteine in unterschiedlichen neuralen Zelltypen des Nervensystems als transgene Marker verwendet werden können. Da Varianten fluoreszenter Proteine aus Riffkorallen (RCFPs) sowie aus Quallen (GFP- Varianten) einen weiten Spektralbereich umfassen, sind diese Tiere hilfreich bei der Analyse von spezifischen Zelltypen, da sie miteinander sowie mit einer grossen Auswahl an Farbstoffen für funktionelle Bildgebung wie fluoreszente Ca2+\- oder Cl--Indikatoren kombiniert werden können. Die morphologische und physiologische Analyse dieser transgenen Zellen legte nahe, dass wichtige zelluläre Eigenschaften nicht beeinträchtigt und daher vergleichbar mit Wildtypzellen sind. Im Gegensatz zu den GFP-Varianten bilden alle untersuchten RCFPs zeit- und milieuabhängig fluoreszente Aggregate in transgenen Mäusen. Diese Aggregate sind nicht toxisch für die Zellen, verringern aber den Nutzen dieser Tiere für morphologische Untersuchungen. Induzierbare Genmodifikationen mit Hilfe des Cre/LoxP-Systems stellen ein wertvolles Werkzeug für die Analyse von Genfunktionen im aktiven Tier dar. Eine konstitutive Cre-Expression unter der Kontrolle des GFAP-Promotors führt neben der erwünschten Rekombination in Astrozyten auch zur Rekombination in neurogenen Vorläuferzellen, den embryonalen radialen Gliazellen. Um eine temporale Kontrolle der Genrekombination ausschliesslich in Astrozyten zu ermöglichen, wurde eine transgene Mauslinie hergestellt, die CreERT2 getrieben vom GFAP-Promotor exprimiert. CreERT2 ist ein Fusionsprotein zwischen der Cre-Rekombinase und der mutierten Ligandenbindungsdomäne des Estrogenrezeptors. In transgenen Nachkommen von Verpaarungen zwischen diesen TgN(hGFAP-CreERT2)-Mäusen und verschiedenen Cre-Reporterlinien lösten bereits wenige tägliche intraperitoneale Injektionen von Tamoxifen eine genomische Rekombination ausschliesslich in Astrozyten fast aller Hirnregionen aus. In Bergmann-Glia, die die Hauptgruppe der Astrozyten des Cerebellums darstellt, wurde mit ca. 90 % eine nahezu vollständige Rekombinationsquote erreicht. Nach einer corticalen Stichverletzung induzierte die simultane Gabe von Tamoxifen eine beachtliche Rekombination in reaktiver Glia im Bereich um die Läsionsstelle herum. Transgene TgN(hGFAP-CreERT2)-Mäuse erlauben die funktionelle Analyse von LoxP- flankierten Genen in Astrozyten des postnatalen und adulten Gehirns. Erste Experimente, in denen die im Rahmen dieser Arbeit generierten und charakterisierten Mauslinien Verwendung finden, wurden erfolgreich durchgeführt. Diese neuen Mauslinien stellen damit wichtige Werkzeuge für die Untersuchung von Neuron-Glia-Interaktionen dar.

Which role do interactions between neurons and glial cells play in information processing, learning and memory in the brain? Many important questions in the field of neuron-glia interaction can be addressed using the transgenic mouse lines generated and characterized in this work. In this work it could be shown that different fluorescent proteins can be used as transgenic markers in different neural cell types of the nervous system. Since variants of reef coral fluorescent proteins (RCFPs) as well as variants of green fluorescent protein from jelly fish (GFP) cover a wide spectral range, these animals allow the analysis of specific cell types and can in addition be combined with each other as well as with a large variety of dyes for functional imaging like fluorescent Ca2+\- or Cl--indicators. The morphological and physiological analysis of these transgenic cells suggested that important cellular characteristics are not impaired and identical to wild type cells. In contrast to GFP variants all examined RCFPs formed fluorescent aggregates in transgenic mice in a time- and environment-dependent fashion. These aggregates are not toxic for the cells, however, they reduce the usefullness of these animals for morphological investigations. Inducible gene modification using the Cre/LoxP system represents a valuable tool for the analysis of gene functions in the active animal. Besides the desired recombination in astrocytes, a constitutive expression of Cre recombinase under the control of the GFAP promoter leads to recombination in neurogenic cells, the embryonic radial glial cells. In order to achieve a temporal control of recombination exclusively in astrocytes, a transgenic mouse line was generated, which expresses CreERT2 under the control of the GFAP promoter. CreERT2 is a fusion protein of Cre recombinase and the mutated ligand binding domain of the estrogen receptor. In transgenic offspring from these TgN(hGFAP-CreERT2) mice and different Cre reporter lines daily intraperitoneal injections of tamoxifen caused a genomic recombination exclusively in astrocytes of nearly all brain regions. In Bergmann glial cells, which represent the main group of astrocytes in the cerebellum, nearly all cells showed successful recombination. After cortical stab wound lesions and simultaneous application of tamoxifen, a considerable recombination in reactive glia was induced within the lesion site. Transgenic TgN(hGFAP- CreERT2) mice permit the functional analysis of LoxP flanked genes in astrocytes of the postnatal and adult brain. Initial experiments using the mouse lines generated and characterized in the context of this work were performed successfully. In summary, these newly generated mouse lines will be of great value for studing neuron-glia interaction.