Charakterisierung der Neuroglia-Differenzierung nach Neurotrauma und während der Hirnentwicklung mit neuen transgenen Mausmodellen

Abstract

Transgene Mausmodelle mit fluoreszenter Proteinexpression unter der Kontrolle zelltyp-spezifischer Promotoren ermöglichen es neurale Zelltypen in gesundem wie geschädigtem Gewebe zu visualisieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, welche Auswirkungen akute Hirnverletzungen auf Astrocyten und Oligodendrocyten haben. Dafür wurde eine Mauslinie verwendet, die in Astrocyten EGFP unter dem Promotor des sauren Gliafaserproteins (GFAP) und in Oligodendrocyten DsRed1 unter der Kontrolle des Proteolipidprotein-Promotors (PLP) exprimiert. Zwei verschiedene Hirn-Trauma-Modelle wurden für die Untersuchungen herangezogen: die kortikale Stichverletzung und die mittlere cerebrale Arterienocclusion, die als Analogon zum Hirnschlag angesehen wird. In beiden Modellen konnten posttraumatisch Zellen identifiziert werden, die sowohl EGFP als auch DsRed1 exprimierten, und damit gleichzeitig astro- wie oligodendrogliale Eigenschaften zeigten. Diese AO-Zellen (für astroglial und oligodendroglial) erschienen frühestens drei Tage nach der Verletzung in unmittelbarer Nähe zum Verletzungsherd. Sie konnten aber bereits 15 Tage nach der Verletzung nicht mehr detektiert werden. Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass die AO-Zellen mit Markern für oligodendrogliale Vorläuferzellen markiert werden können, aber keine neuronalen Eigenschaften besitzen. Um die weitere Differenzierung der AO-Zellen zu verfolgen, wurden neue transgene Mausmodelle hergestellt, die unter GFAP- und PLP-Promotor Fragmente der Cre- DNA-Rekombinase exprimierten. Die Komplementierung dieses Proteins führt zu einem aktiven Enzym, das in der Lage ist LoxP-flankierte DNA-Sequenzen zu schneiden. Die Verwendung eines Reportersystems mit Stop-gefloxter EYFP- Kassette im ROSA26-Locus (TgH(ROSA26-flox-Stop-flox-EYFP)ROSY) ermöglichte die Visualisierung der Rekombination in Zellen mit erfolgreicher Komplementierung. Die Verwendung der neuen doppelt-transgenen Mausmodelle zeigte eine simultane Aktivierung von GFAP- und PLP-Promotor in der embryonalen Entwicklung der Mäuse, was zur Markierung von Gliazellen (hauptsächlich protoplasmatische Astrocyten und NG2-Glia) führte. Ebenso konnten Zellen mit DNA-Rekombination als Zeichen der koinzidenten Promotor-Aktivität auch nach akuten Hirnschädigungen beobachtet werden. Acht Tage nach der Verletzung wurden die ersten Zellen mit DNARekombination detektiert. Vier bis acht Wochen später zeigte sich die Differenzierung zu protoplasmatischen, GFAP-positiven Astrocyten. Um den Anwendungsbereich der Cre-Komplementierung weiter zu testen, wurden rekombinante adeno-assoziierte Viren verwendet und die beiden Cre-Fragmente unter glialen bzw. interneuronalen Promotoren exprimiert. Die Injektion in den Kortex bzw. den Hippocampus der ROSY-Reportermäuse führte zur selektiven Markierung von Gliazellen bzw. Interneuronen. 96 Die Verwendung der neuen transgenen Mausmodelle ist das erste Beispiel einer in vivo Komplementierung unter Verwendung zweier verschiedener Promotoren und damit ein Beispiel für eine in vivo Koinzidenzdetektion zweier Promotoren. Dieser Ansatz zeigt, dass es 1. möglich ist in vivo die Cre-Rekombinase zu komplementieren und so einen Subtyp von Zellen (hier gezeigt für Gliazellen und Interneurone) zu markieren und dass 2. während einer Läsion Oligodendrocytenvorläuferzellen aktiviert werden, die sich zunächst zu AO- Zellen mit oligodendroglialen als auch astroglialen Eigenschaften differenzieren, und anschliessend protoplasmatische Astrocyten werden. Die hier gefundenen Zellen haben das Potential als Vorläuferzellen für reife Astrocyten im Verletzungsfall des ZNS zu dienen.

The use of transgenic mouse models with green fluorescent astrocytes and red fluorescent oligodendrocytes allows the direct visualisation of cellular responses in the healthy and injured brain. After acute traumatic lesions or ischemic stroke in the neocortex fast neuronal and glial cell death is frequently observed. Activations of different glial cells like astroglia, oligodendrocytes and microglia cells are sequelae of secondary injury processes. A complex and not yet understood sequence of cellular responses initiate functional recovery after such neurodegenerative processes. Here, we applied cortical stab wound lesioning and middle cerebral artery occlusion (MCAO, an animal model of ischemic stroke) to characterize the responses of glial cells such as astrocytes and oligodendrocytes in close proximity to the lesion site. Three days after the lesion, we detected glial cells that displayed, both, astro- and oligodendroglial properties recognized by a simultaneous expression of GFAP- and PLP-promoter driven EGFP and DsRed1. Therefore, these cells were designated AO cells. Since AO cells could be labelled by the oligodendroglial progenitor markers Olig2 and Sox10, but not for neuronal or mature astrocyte markers, we classified them as activated oligodendroglial progenitor cells (OPC). Since AO cells disappeared about 15 days after the injury, we could not follow their fate in the double-transgenic fluorescent mice. Therefore, we developed a mouse model in which the transient signal, i.e. co-activity of GFAP and PLP promoter upon injury, could be switched into a permanent one. Cre/LoxP recombination is the gold standard for conditional gene modification in vivo. The Cre DNA recombinase recognizes loxP sites and catalyzes DNA excision between two loxP sites. Here, we designed inactive "split-Cre" fragments that regain enzymatic activity upon overlapping activity of two different promoters. We took advantage of the functional complementation of split Cre DNA fragments as coincidence detectors and generated transgenic mice in which N- and C-terminal Cre fragments (NCre and CCre) were targeted by the GFAP and PLP promoter. In cells of these transgenic mice (crossed to a ROSA26 reporter mouse) the fragments complemented each other when both promoters were simultaneously active. The functional Cre recombinase with reconstituted enzyme activity modified DNA sequences with flanking loxP sited. Using these new transgenic mouse lines we could show that after acute injuries AO cells differentiate into protoplasmatic GFAP-positive astrocytes in vivo. Additionally, in the brain of transgenic mice with coincident activities of PLP- and the GFAP promoter during development, we could genetically define a subgroup of progenitor cells that give rise to glial cells (astrocytes, oligodendrocytes and NG2-glia) and neurons. 98 Due to its flexibility viral infection has become a common tool to genetically label or modify cells in vivo. The broad-range applicability of the split-Cre system was confirmed, when we used adeno-associated viral gene transfer to express NCre and CCre fragments. A subset of interneurons was labeled by the using GAD67- and CCK promoters to express split-Cre in vivo.