dc.contributor.author
Sauer, Sascha
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:48:32Z
dc.date.available
2002-06-19T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8459
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12658
dc.description
TITLE PAGE
INTRODUCTION 2
MATERIALS AND METHODS 28
RESULTS 50
DISCUSSION 92
ABSTRACT 110
ZUSAMMENFASSUNG 111
APPENDIX 113
dc.description.abstract
After the completion of the Human Genome Sequencing Project, genome research
is bound to focus on genome variation studies. Therefore efficient high-
throughput genotyping technologies for DNA markers, particularly for single
nucleotide polymorphisms (SNPs) are very sought-after. Many methods for SNP
analysis, such as DNA microarrays, gel-based and plate-reader based assays
have been developed but none of these compete with the rapid detection and
resolution of mass spectrometers. Particularly matrix-assisted laser
desorption/ionisation mass spectrometry (MALDI-MS) has revolutionised the
analysis of proteins and DNA. Nevertheless, it was universally acknowledged
that one of the major problems of DNA analysis by MALDI-MS was to achieve
sufficient sample purity. This limits significantly high-throughput, as
automation of current purification procedures is cumbersome and expensive. The
main benefit of the novel approaches described in this thesis consists in the
use of MALDI-sensitivity enhancing DNA chemistry termed "charge-tagging". This
DNA modification chemistry was implemented in several different molecular
biological procedures for the generation of allele-specific products of SNPs.
Therefore purification or concentration procedures as for any other technique
using MALDI-MS are not required. Each of the presented approaches starts with
a PCR. Assays termed the GOOD assays and the simplified GOOD assay use primer
extension for the generation of allele-specific and charge-tagged DNA
products. Additionally, procedures using ligases or flap-endonucleases for the
generation of such products are shown. Among these methods the simplified GOOD
assay is potentially the most powerful as it is executed with the shortest
reaction sequence and completely void of chemistry. The simplified GOOD assay
is a purification-free, single-tube, three-step procedure consisting of PCR,
primer extension and phosphodiesterase II digestion followed by mass
spectrometric analysis, while for the GOOD assays an additional alkylation
step takes place after phosphodiesterase digestion. The GOOD assays and the
simplified GOOD assay are performed with simple liquid-handling at lowest
manageable volumes, thermal incubation and thermocycling steps and were
successfully implemented in an automated process for high-throughput SNP
genotyping.
de
dc.description.abstract
Nach Beendigung der Sequenzierung des humanen Genoms wird sich die
Genomforschung auf die Untersuchung von Variationen im humanen Genom
konzentrieren. Deshalb sind effiziente Hoch-Durchsatz
Genotypisierungstechnologien zur Analyse von DNA-Markern, insbesondere für
"single nucleotide polymorphisms" (SNPs) besonders gefragt. Viele Methoden wie
DNA-Chips, gel-basierende Verfahren und Prozeduren, die auf Mikrotiterplatten
ausgeführt werden, wurden für die SNP-Analyse entwickelt. Keine dieser
Methoden kann jedoch mit der schnellen und hochaufgelösten Detektion von
Massenspektrometern konkurrieren. Besonders die Matrix-assistierte Laser
Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI-MS) hat die Analyse von
Proteinen und DNA revolutioniert. Nichtsdestotrotz wurde bald klar, dass eines
der prinzipiellen Probleme der DNA-Analyse mittels MALDI-MS darin besteht,
eine genügend reine Probe zu gewährleisten. Dies limitiert signifikant den
Hoch-Durchsatz, da die Automation mit derzeitigen Aufreinigungsmethoden
umständlich und kostspielig ist. Der entscheidende Vorteil der neuen Methoden,
die in dieser Arbeit gezeigt werden, besteht in der Verwendung
empfindlichkeits-steigender DNA-Chemie, deren Anwendung als "charge-tagging"
bezeichnet wird. Diese DNA-Modifikationschemie wurde in mehrere verschiedene
molekularbiologische Verfahren zur Generierung allel-spezifischer DNA-Produkte
von SNPs implemetiert. Deshalb werden Aufreinigungen und Aufkonzentrationen
wie sie jede andere Technologie, die MALDI-MS verwendet, nicht benötigt. Jede
der gezeigten Prozeduren beginnt mit einer PCR. Die "GOOD assays" und der
vereinfachte "GOOD assay" benötigen eine Primer-Extension für die Generierung
allel-spezifischer und ladungs-konditionierter DNA. Zusätzlich sind
Prozeduren, die Ligasen oder "Flap"-Endonukleasen für die Generierung solcher
Produkte benutzen, gezeigt. Unter allen diesen Methoden ist der vereinfachte
"GOOD assay" potentiell der Beste, da dieser mit der kürzesten
Reaktionssequenz und völlig ohne Chemie auskommt. Der vereinfachte "GOOD
assay" ist eine aufreinigungs-freie, Ein-Topf- und 3-Schritt-Prozedur
bestehend aus PCR, Primer Extension und Phosphodiesterase II-Verdau gefolgt
von massenspektrometrischer Analyse, während für die "GOOD assays" in einem
zusätzlichen Schritt noch eine Alkylierungsreaktion nach dem
Phosphodiesterase-Verdau hinzukommt. Die "GOOD assays" und der vereinfachte
"GOOD assay" wurden mit einfachen Pipettierschritten bei kleinst-machbaren
Volumina, Inkubationen und thermozyklischen Schritten durchgeführt, und sie
wurden erfolgreich in einen automatisierten Prozess für die Hoch-Durchsatz-
Genotypisierung von SNPs implementiert.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Mass Spectrometry
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Technology development for genotyping single nucleotide polymorphisms
dc.contributor.firstReferee
Prof. Hans Lehrach
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Volker A. Erdmann
dc.date.accepted
2002-06-07
dc.date.embargoEnd
2002-06-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002001020
dc.title.translated
Technologieentwicklung zur Genotypisierung von Einzelnukleotidpolymorphismen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000000665
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/102/
refubium.mycore.derivateId
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