Expression und funktionelle Charakterisierung des orphanen murinen und humanen Taar8

Abstract

Im Rahmen von genomweiten Screenings nach weiteren Serotonin-Rezeptor-Subtypen wurde 2001 eine neue Gruppe an G-Protein koppelnden Rezeptoren kloniert. Diese als trace amine-associated receptors (Taar) bezeichnete Rezeptoren gehören zur Familie A innerhalb der GPCRs und werden sowohl durch Spurenamine als auch durch Thyronamine aktiviert. Eine der bekanntesten Thyronamine ist das 3-Iodothyronamin (T1AM), welches am murinen Herzen negativ chronotrope und negativ inotrope Effekte zeigte. Es stellte sich also die Frage, ob und welcher Taar diese Effekte vermittelt haben konnte. Bis zum damaligen Zeitpunkt waren lediglich Gαs-koppelnde Taar- Subtypen wie der Taar1 und der Taar4 bekannt, welche diese negativ modulierenden Effekte nicht hervorrufen konnten. Ebenso wenig konnte der Gαq/11-koppelnde Taar5 als ursächlich für die beobachteten Effekte angenommen werden. Jedoch zeigte sich in ersten Expressionsstudien eine deutliche Expression des Taar8a in Herzen von Ratten, so dass die beobachteten Effekte möglicherweise durch diesen orphanen Rezeptor erklärt werden konnten; allerdings war der Signalweg noch nicht bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mithilfe verschiedener Techniken murine Herzen von C57BL/6J-Mäusen auf ihre Expression des homologen Taar8b hin untersucht. Letztendlich konnte mittels in-situ-Hybridisierung keine Detektion von Transkripten in diesen murinen Herzen erfolgen und somit eine Expression bei männlichen gesunden C57BL/6J-Mäusen ausgeschlossen werden. Weiterhin galt es jedoch, den Rezeptor zu deorphanisieren. Aus diesem Grund erfolgte eine funktionelle Charakterisierung inklusive der Generierung von verschiedenen Varianten, die zum einen die Bedingungen für Ligandenuntersuchungen verbessern und zum anderen die Identifizierung der G-Protein Kopplung erleichtern sollten. Diesbezüglich zeigte sich eine deutliche Basalaktivität der murinen und humanen Variante für die Gαi/o-Kopplung. Der Taar8 ist somit der erste Gαi/o-koppelnde Rezeptor innerhalb der Taars. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Liganden wie 3-Iodothyroamin (T1AM) oder β- Phenylethylamin (PEA) keine Liganden für die humane und murine Variante sind. Somit konnte zwar bisher noch kein Taar8-spezifischer Ligand gefunden werden, jedoch erwies sich dieser als basalaktiv; zudem wurde erstmals ein Gαi/o-koppelnder Rezeptor identifiziert.

In the context of genome wide screenings for more subtypes of the serotonin receptor, a new group of g-protein coupling receptors was cloned in 2001. These receptors called trace amine-associated receptors (taar) belong to the family A within the GPCRs and are activated of both trace amines and thyronamines. One of the most well known thyroanimnes is 3-iodothyronamine (T1AM), which is known to induce negative chronotropic and negative inotropic effects on murine hearts. So the question was, if and which taar is responsible for inducing these effects. At that point only Gαs-coupling taars as the Taar1 and the Taar4 were known, which obviosly could not be responsible for these negative modulating effects in heart physiology. Even the Gαq/11-coupling Taar5 could not have been responsible for the observed results. However, a clear preponderance of Taar8a transcripts was found in first expression profile analyses in rat hearts, so that this orphan receptor could possibly be the explanation for the cardial effects; however signal transduction was not identified yet. Within the scope of this work several techniques were used to analyze the expression pattern of the homologue Taar8b in murine hearts of C57BL/6J-mice. Eventually, there was absolutely no detection of Taar8b transcripts in these murine hearts with the help of in- situ-hybridization and we could exclude an expression in male healthy C57BL/6J- mice. Furthermore, it was an aim to deorphanize this receptor. This is the reason why we performed functional charachterization including generation of several variants which should be helpful on the one hand for ligand-stimulation analyses and on the other hand for the identification of the G-protein coupling. Within these investigations a significant basal activity for Gαi/o-protein coupling for the human and the murine receptor. So, Taar8 is the first identified Gαi/o-coupling receptor within the Taars. Furthermore, there was no activation in any G-protein coupling for the human or murine Taar8b after the stimulation with 3-iodothyronamine (T1AM) or β-phenylethylamine (PEA). So in conclusion, there is no taar8 specific ligand identified so far but the receptor was shown to be basal active; additionally it was the first time ever to identify a Gαi/o-protein coupling receptor.