Nocardia farcinica aktiviert humane dendritische Zellen und induziert die Sekretion von Interleukin-23

Abstract

Bis heute fehlt für viele Infektionskrankheiten ein wirksamer Impfstoff. Ein Hauptproblem liegt in der mangelhaften Induktion starker zellulärer Immunantworten, vermittelt von spezifischen CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, durch die momentan angewandten Impfstrategien. Bessere Ergebnisse sind wahrscheinlich über den Einsatz neuartiger Adjuvantien möglich. DCs spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Differenzierung naiver T-Lymphozyten. Peripher lokalisierte DCs werden durch den Kontakt mit Antigenen aktiviert, wandern anschließend in die T-Zellregionen der drainierenden Lymphknoten und aktivieren dort naive T-Zellen. Die dabei synthetisierten Zytokine haben einen Einfluss darauf, welche Form der Immunantwort initiiert wird. Die Applikation von Mykobakterien mit Antigen, z.B. im kompletten Freund Adjuvans, führt zu starken zellulären Immunantworten. Gegen den Einsatz der Bakterien als Adjuvans spricht jedoch ihre hohe Toxizität. Nocardien sind eine den Mykobakterien eng verwandte Bakteriengattung, Sie sind jedoch weniger toxisch und besitzen nur eine geringe Pathogenität bei immunkompetenten Individuen. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Interaktion von DCs mit Nocardien, hier Nocardia farcinica, im Hinblick auf eine mögliche Verwendung der Bakterien (oder ihrer Bestandteile) als Adjuvans zu untersuchen. Daten hierzu lagen nicht vor. Zu diesem Zweck wurden humane DCs aus peripheren Monozyten differenziert und mit N. farcinica inkubiert. Anschließend erfolgte die Phänotypisierung der Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Außerdem wurden für die Induktion zellulärer Immunantworten essentielle Zytokine im Vergleich mit LPS als potenten DC- aktivierenden Stimulus analysiert. Besonderes Augenmerk lag dabei auf der Analyse von Zytokinen der IL-12-Familie, da diese wesentlich an der T-Zellpolarisierung beteiligt sind. Außerdem wurde das Potential, TLymphozyten zur Proliferation anzuregen, in gemischten Leukozytenreaktionen untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass DCs N. farcinica phagozytieren und die Bakterien intrazellulär abtöten. Je höher die eingesetzte Bakteriendosis in diesen Versuchen war, desto größer war allerdings auch der Anteil apoptotischer DCs. Mit Nocardien inkubierte DCs wurden jedoch nachhaltig aktiviert, was sich anhand der Expression typischer Reifungsmarker nachweisen ließ. Dabei zeigte sich, dass auch nicht infizierte Zellen ausreiften. Hierfür waren lösliche Stoffe (von den Bakterien sezernierte oder Zytokine) nicht verantwortlich, da sich der DC-aktivierende Effekt von mit Nocardien inkubierten DCs mittels Zellkulturüberstand auf nicht aktivierte Zellen nicht übertragen ließ. Dagegen induzierten inaktivierte Nocardien ebenfalls eine DC-Reifung. Die durch N. farcinica induzierte Aktivierung der DCs spiegelte sich auch in einer verstärkten Aktivierung der Proliferation allogener T-Zellen wieder. Hinsichtlich der Zytokinsekretion zeigte sich, induziert durch die Nocardien, eine ausgeprägte Synthese von IL- 12p40, die Menge des IL-23 entsprach dabei ca. dem 7-fachen des IL- 12p70-Anteils. Gleichzeitig sezernierten mit Nocardien inkubierte DCs auch IL-10. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass N. farcinica bereits in geringer MOI humane DCs aktiviert. Die Analyse des Zytokinspektrums von mit N. farcinica inkubierten DCs legt nahe, dass die Bakterien bei möglicher Verwendung als Adjuvans eher die Induktion von TH17- als von TH1-Immunantworten unterstützen könnten.

To date many infectious diseases are lacking sufficient vaccines. The main problem is an insufficient activation of cellular immune responses mediated by CD4 and CD8 T-lymphocytes in common vaccination strategies. To improve this situation development of new adjuvants is needed. DCs play a major role in activation and differentiation of naïve T-lymphocytes. Peripheral DCs are activated by antigen contact, then traffic to the draining lymph nodes and activate naïve T-cells. The type of immune response initiated by the DCs depends on the secreted cytokines. Application of Mycobacteria with antigen, e.g in Freunds complete Adjuvans, drives a strong cellular immune response, but shows high toxicity and is not used in human. Nocardia is a closely related genus to mycobacteria. They are less toxic and infections are rarely seen in immunocompetent individuals. The aim of this work was to study the interaction between DCs an N. farcinica with regard to a potential use of the bacterium as an adjuvant. Human peripheral monocytes were differentiated to DCs and stimulated with N. farcinica. Activation was verified by flow cytometry analysis. Cytokine secretion was quantified with special attention to the IL-12 family. Activation of T-lymphocytes was tested in mixed leukocyte reactions. We show phagocytosis of N. farcinica by dendritis cells without intracellular survival of the bacteria. Apoptosis of DCs depends on the dose of N. farcinica. Furthermore, stimulation of DCs with live or heat-killed N. farcina leads to activation of infected and bystander DCs. Stimulation of naïve DCs with supernatants from co-cultures of DCs and Nocardia does not result in activation. Nocardia-stimulated DCs activate T-lymphocytes and induce proliferation. Analysis of the cytokine secretion revealed synthesis of IL-12p40, IL-12p70, IL-23 and IL-10, with IL-23 7-fold higher than IL-12p70. In summary, N. farcinica is a potent activator of DCs. As IL-23 outranged IL- 12p70 secretion a TH17-differentiation of the activated T-lymphocytes is more likely than induction of a TH1-response.