Investigation of Virus-Like-Particles and Antigen-Loaded Poly-Lactic-Acid Particles for Transcutaneous Vaccine Delivery

Abstract

Novel routes of immunization could help improve immune response, spare vaccine and could help increase the vaccination coverage, especially when they allow for non-invasive vaccine delivery. Due to the presence of different immunocompetent cells, the skin is a highly interesting target organ for novel vaccination routes. Previous studies showed that targeting the hair follicle is a promising strategy for the delivery of large molecules and particles. However, the principal challenge is to find a vaccine compound, which is stable in the skin environment, penetrates sufficiently across the skin barrier and effectively targets resident immune cells. In this study, novel experimental vaccine compounds against HIV-1 antigens were investigated for their ability to penetrate human skin. Three types of fluorescently labeled virus-like particles (VLP), including VLP-Gag-eGFP, VLP-Gag-gp140-eGFP, and VLP-Pr55Gag-CFDA, plasmid DNA, and polylactic acid particles carrying plasmid DNA and the HIV-1 capsid protein gp140, were studied in excised human skin ex vivo. Short-term incubation in a humidified chamber for 16 hours as well as a newly established tissue culture model for incubation and cell migration studies for up to 40 hours were used as experimental models. Skin penetration and cellular uptake were studied by fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, and flow cytometry of cells isolated from the skin as well as migratory cells. Invasive and non-invasive techniques were used for administration of the model vaccines on the skin. Cyanoacrylate skin surface stripping, a non-invasive technique performed prior to vaccine administration, which targets hair follicles by opening follicular orifices and improving particle entry into the hair follicle canal, was compared to skin pricking or intradermal injection, respectively. Although each VLP type exhibited a different uptake pattern, VLPs in general could be detected in almost all skin samples, and VLP-positive cells were found in epidermal and dermal cell suspensions in excised human skin and in the cells isolated from the human skin ex vivo and in vitro, respectively. In the human skin culture model VLPs were found in the cells isolated from skin tissue and in cells that migrated out of the skin. The VLP uptake by epidermal and dermal cells was slightly higher after pricking than after cyanoacrylate skin surface stripping. Interestingly, even a non-invasive administration method appeared to promote VLP translocation to the dermal layer. Also, the non-invasive method induced similar migration of cells out of the skin and similar particle uptake by activated cells when compared to pricking. Expression of plasmid DNA in human skin ex vivo was not observed, neither after application of naked DNA nor after administration of the PLA-protein-bound plasmid. Cell culture studies suggested PLA-particle uptake and successful gp140 delivery but still no expression of plasmid encoded green-fluorescent protein. These results suggest that VLPs are suitable carriers for skin vaccination, because they appear to stay intact during skin barrier penetration and cellular uptake. Both, non- invasive and invasive methods of application were effectively targeting the immune cells in skin. Even non-invasive administration induced cellular uptake and migration of activated immune cells. The results are in line with previous studies showing that cyanoacrylate skin surface stripping enhances penetration and activates skin immunoactive cells. The lack of plasmid DNA expression might be due to insufficient transfection in this model because cellular uptake of the co-delivered protein could be shown. Hence, although biodegradable nanoparticles offer great potential for co-delivery of different forms of vaccine, further research is required to ensure effective skin penetration and cellular uptake of such complex architectures.

Einbringen von Impfstoffen über andere Wege als klassische Injektionen könnte helfen Immunantworten zu verbessern, Vakzin einzusparen und Impfraten zu verbessern, besonders wenn die Impfung auf nicht invasivem Weg erfolgen kann. Aufgrund der Anwesenheit von verschiedenen immunkompetenten Zellen ist die Haut ein sehr interessantes Zielorgan für neuartige Impfstrategien. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Targeting von Haarfollikeln eine vielversprechende Strategie für das effektive Einbringen von großen Molekülen und Partikeln ist. Allerdings ist die wichtigste Herausforderung einen Impfstoff zu finden, der in der Haut stabil ist, ausreichend durch die Hautbarriere penetriert und residente Immunzellen effektiv erreicht. In dieser Studie wurden neuartige Arten von experimentellen Impfstoffen gegen HIV-1-Antigene auf ihre Fähigkeit die menschliche Haut zu penetrieren untersucht. Drei Arten von Fluoreszenz-markierten, Virus-ähnlichen Partikeln (VLP), (VLP-Gag-eGFP, VLP-Gag-gp140-eGFP und VLP-Pr55Gag-CFDA), sowie Plasmid- DNA, Polymilchsäure-Partikel mit Plasmid-DNA und dem HIV-1 Capsid-Protein gp140 wurden in exzidierten menschlichen Haut ex vivo erforscht. Als experimentelle Modelle wurden die Kurzzeit-Inkubation in einer feuchten Kammer für 16 Stunden, ein neu entwickeltes Gewebekulturmodell und Zellmigrationsstudien über bis zu 40 Stunden etabliert und verwendet. Hautpenetration und Zellaufnahme wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie, Durchflusszytometrie isolierter Hautzellen sowie migrierten Zellen untersucht. Invasive und nicht-invasive Verfahren wurden für die Applikation der Impfstoffe auf die Haut verwendet. Als eine nicht-invasive Methode für die Verabreichung von Partikeln wurde die Cyanacrylat Abtragung der Hautoberfläche verwendet, dadurch wird das Haarfollikel-Targeting verbessert. Diese Methode wurde mit der Pricking Technik oder der intradermalen Injektion vergleichen. Obwohl jeder VLP-Typ ein anderes Aufnahme-Muster zeigte, konnten VLPs allgemein in fast allen Hautproben nachgewiesen werden. Außerdem wurden VLP-positive Zellen in epidermalen und dermalen Zellsuspensionen aus exzidierter Humanhaut ex vivo und in den isolierten Zellen der menschlichen Haut in vitro gefunden. Im Gewebekulturmodell wurden VLPs in den aus der Haut migrierten Zellen gefunden. Die VLP-Aufnahme durch epidermale und dermale Zellen war etwas höher als nach Pricking. Interessanterweise schien sogar die nicht-invasive Methode zur Verabreichung der VLPs die Translokation in der Haut zu fördern. Auch diese nicht-invasive Methode induzierte eine ähnlich hohe Migration von Zellen aus der Haut und eine ähnlich hohe Partikelaufnahme von aktivierten Zellen im Vergleich zum Pricking. Im Gegensatz dazu wurde die Expression von Plasmid-DNA in der menschlichen Haut ex vivo nicht beobachtet, weder nach der Applikation purer DNA oder nach der Verabreichung des PLA-Protein-gebundenen Plasmids. Zellkulturstudien zeigten eine PLA-Partikelaufnahme und erfolgreiches Einbringen von gp140 Protein, aber keine Expression der Plasmid-kodierten grün-fluoreszierenden Proteins. Unsere Ergebnisse deuten darauf, dass VLPs geeignete Träger für die Hautimpfung sind, weil sie während der Penetration der Hautbarriere und der zellulären Aufnahme scheinbar intakt bleiben. Die beiden nicht-invasiven und invasiven Methoden erreichten effektiv die Immunzellen in der Haut. Auch nicht-invasive Verabreichung induzierte eine zelluläre Aufnahme und die Migration von aktivierten Immunzellen. Die Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die zeigten, dass Cyanacrylat-Abrisse die Penetration verbessern und die Immunität aktivieren. Das Fehlen von Plasmid-DNA-Expression ist möglicherweise erklärbar aufgrund unzureichender Transfektion in diesem Modell, da die zelluläre Aufnahme des co-gelieferten-Proteins nachgewiesen wurde. Obwohl biologisch abbaubare Nanopartikel ein großes Potenzial der Applikation der verschiedenen Formen der Impfstoff bieten, ist weitere Forschungen erforderlich, um die Hautpenetration und zelluläre Aufnahme von solchen komplexen Architekturen zu gewährleisten.