dc.contributor.author
Schwanke, Anja
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:47:58Z
dc.date.available
2009-10-02T11:26:24.835Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8441
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12640
dc.description
1 EINLEITUNG 1.1 Aufbau der Haut 1.2 Formen des hellen Hautkrebses 1.3
Aktuelle Therapieoptionen bei hellem Hautkrebs 1.3.1 Physikalische
Therapiemethoden 1.3.2 Pharmakotherapie 1.3.3 Kombinationstherapien 1.4
Kolorektal-, Mamma-, Zervix- und Blasenkarzinom 1.5 DNA Polymerase alpha 1.5.1
DNA Polylmerasen 1.5.2 DNA Polymerase alpha und Pol-α-Primase-Komplex 1.5.3
Zellzyklus und Apoptose 1.5.4 DNA Replikation durch die Pol α 1.6 Hemmstoffe
der DNA Polymerase alpha 1.6.1 Nicht-nukleosidische Hemmstoffe 1.6.2
Nukleosid- und Nukleotid-Analoga 1.7 Fragestellung und Zielsetzung der
vorliegenden Arbeit 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Geräte 2.1.2
Reagenzien und Verbrauchsmaterialien 2.1.3 Zelllinien 2.1.4 Nährmedien und
Lösungen 2.1.5 Säulen für die HPLC und SPE 2.2 Methoden 2.2.1 Gewinnung und
Kultivierung von primären Hautzellen und Zelllinien 2.2.2
Viabilitätsuntersuchungen 2.2.3 Untersuchungen zur Zellproliferation 2.2.4
Durchflusszytometrische Untersuchungen (FACS) 2.2.5 HPLC Analytik 2.2.6
Festphasenextraktion 2.2.7 Statistik 3 ERGEBNISSE 3.1 Zellspezifische
Untersuchungen 3.1.1 Thymidin-Analoga 3.1.2 Guanosin-Analoga 3.1.3 Guanosin-
Analoga mit Phosphonatgruppe (Phosphonate) 3.1.4 Diethylester-Vorstufen der
Phosphonate 3.1.5 Korrelation Molecular Modelling – Zytotoxizität 3.2 Analytik
3.2.1 Entwicklung der HPLC-Methode für die Thymin- und Guanin-Reihe 3.2.2
Entwicklung der HPLC-Methode für OxBu und OxHex 3.2.3 Entwicklung einer
Festphasenextraktion 4 DISKUSSION 4.1 Zellspezifische Untersuchungen 4.1.1
Auswahl der Referenzsubstanzen und Zielzellen 4.1.2 Nicht-Phosphonate 4.1.3
Phosphonate 4.1.4 Ausblick – Weiterentwicklung der Phosphonate 4.2 Analytische
Untersuchungen 4.2.1 Analytik der Nicht-Phosphonate 4.2.2 Analytik der
Phosphonate 4.2.3 Analytik des Metabolismus 4.2.4 Ausblick – Weiterentwicklung
der Analytik 5 ZUSAMMENFASSUNG 6 LITERATUR
dc.description.abstract
Die Inzidenz von hellem Hautkrebs hat in den letzten Jahrzehnten, auch
aufgrund zu hoher UV-Licht-Exposition, stark zugenommen. Die derzeitigen
topischen Therapieoptionen sind entweder schmerzhaft und/oder weisen
unzureichende Heilungsraten auf. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit, einen
neuen therapeutischen Ansatz für die topische Therapie der Aktinischen
Keratose, des Plattenepithelkarzinoms und des Basalioms zu entwickeln. Die Pol
α ist ein vielversprechendes Target, da sie die ersten Schritte der DNA
Replikation katalysiert und mit einer Primase-Funktion assoziiert ist. Die
3-dimensionale Struktur des aktiven Zentrums der humanen Pol α konnte mittels
Molecular Modelling konstruiert und eine Reihe bekannter Pol-α-Inhibitoren in
das aktive Zentrum gedockt werden. Gemäß diesen Berechnungen wurden die neuen
nukleosidischen Verbindungen HM-1-Oxim und isoHex-OH sowie die neuartigen
Nukleotid-Analoga OxBu, OxIsohex, OxHex und deren Diethylester OxBu-DE und
OxHex-DE identifiziert, synthetisiert und im Rahmen dieser Arbeit mittels in-
vitro-Zelltests pharmakologisch gescreent. Mit HM-1-Oxim und isoHex-OH gelang
es weder, den derzeitigen Standard der topischen Therapie – 5-FU – in seiner
Wirkung zu übertreffen, noch Tumorzellen selektiv anzugreifen. Die
Derivatisierung zum Phosphonat an der endständigen 5’-OH-Gruppe des Zucker-
analogen Molekülteils führte zu den besser aktivierbaren Monophosphat-Analoga
OxBu, OxIsohex und OxHex. Untersuchungen an normalen humanen Keratinozyten und
an der Plattenepithelkarzinomzelllinie SCC25 ergaben eine deutliche
Tumorselektivität, wobei OxBu und OxHex SCC25 Zellen schon im nanomolaren
Bereich angriffen. Damit sind diese Phosphonate 1000- bzw. 10000-fach aktiver
als die Vergleichssubstanzen Aphidicolin und 5-FU bzw. BuP-OH. Das Ziel, die
Wirksamkeit von 5-FU und BuP-OH zu übertreffen, wurde erreicht und zudem
tumorselektive Substanzen generiert. Aufgrund ihrer Zytotoxizität wurden OxBu
und OxHex zusätzlich an den Tumorzelllinien HT29, MCF7, T24 und SISO
untersucht und wirkten auch an diesen zuverlässig. Ferner wurden die
Diethylester (DE) von OxBu und OxHex an SCC25 Zellen und NHK auf Zytotoxizität
geprüft, weil die erhöhte Lipophilie zu einer verstärkten Aufnahme in die
Targetzellen führen könnte, in welchen nach enzymatischer Esterspaltung die
Muttersubstanzen freigesetzt werden. OxBu-DE und OxHex-DE zeigten allerdings
ein schlechteres Wirkprofil als die Muttersubstanzen. Im zweiten Teil der
Arbeit sollten eine analytische Detektionsmethode (HPLC) für die Pol-α-Hemmer
und deren voraussichtliche Metaboliten entwickelt sowie eine
Festphasenextraktionsmethode zur Isolierung dieser Metaboliten etabliert
werden. Eine HPLC-Trennung der Modell-Nukleoside Thymidin und Guanosin
inklusive deren DNA Basen und Nukleotide gelang mit Basislinientrennung und
Detektion im nanomolaren Bereich. Mit dieser Methode ließen sich auch die
Testsubstanzen BuP-OH, HM-1, HM-1-Oxim sowie die Nukleosid-Analoga Zalcitabin,
Capecitabin, 5-FU und Aciclovir detektieren. Für die Phosphonate OxBu und
OxHex konnte eine HPLC-Methode mit Adefovir als internem Standard erarbeitet
werden, mit welcher auch die Detektion der (bisher noch nicht synthetisierten)
Diphosphate der Testsubstanzen möglich scheint.
de
dc.description.abstract
Due to an increased UV exposure, the number of patients with actinic keratosis
and cutaneous squamous cell carcinoma has increased dramatically. Current
therapy of actinic keratosis is either painful and/or cure rates are not
totally satisfying. Therefore the aim of this study was an alternative
approach like interference with DNA synthesis. The human DNA polymerase α
catalyzes the very first steps in DNA replication and is tightly associated
with a primase. Therefore, it is an interesting target. Recently, the three-
dimensional structure of the active site of human DNA polymerase α was
proposed based on the application of molecular modelling methods and molecular
dynamic simulations. The modelled structure of the enzyme was used for docking
several known inhibitors in its active site. Novel nucleosides as HM-1-oxime
and isoHex-OH as well as the nucleotide analogs OxBu and OxHex and their
diethylester prodrugs were identified, synthesized and subjected to an in-
vitro-screening. Neither HM-1-oxime nor isoHex-OH surmounted the effects of
5-FU – the current standard for topical therapy of actinic keratosis.
Moreover, no selectivity for tumor cells was observed. Costimulating the cells
with 5-FU and the indicated agents did not improve the outcome either. Next,
the phosphonate derivatives OxBu, OxIsohex and OxHex, containing a
metabolically stable P-C bond, were developed in order to circumvent the
initial activation step. Cytotoxicity testing in normal human keratinocytes
(NHK) and SCC25 cells showed a distinct selectivity of the phosphonates for
tumor cells. OxBu and OxHex affected SCC25 cells even in the nanomolecular
range. Referring to the IC50 values, OxBu and OxHex exceeded the activity of
5-FU and aphidicolin about 1000fold, BuP-OH was outranged about 10.000fold.
Summing up, the aim of exceeding the effects of 5-FU and BuP-OH was achieved.
Additionally, the lack of tumor selectivity has been overcome. Due to their
great potential as antitumor agents for actinic keratosis and squamous cell
carcinoma OxBu and OxHex were tested in other tumor cell lines like HT29,
MCF7, T24 and SISO cells, too. In fact, the phosphonates once more suppressed
the viability of these tumor cell lines very efficiently. Since normal human
keratinocytes produce great amounts of esterases the ability to affect NHK and
SCC25 cells was investigated with the respective diethylesters of OxBu and
OxHex, too. The higher lipophilicity may favour penetration of the target
cell. Unexpectedly, the activity of the phosphonate diethylesters was less
favourable as compared to the activity of OxBu and OxHex. Secondly, an
analytical method (HPLC) ought to be investigated to detect the pol α
inhibitors and their expected metabolites. Additionally, a solid phase
extraction method ought to be established to extract these metabolites from
the cells. An HPLC method was developed analysing the model compounds
thymidine and guanosine including their respective DNA bases and nucleotides.
Baseline separation and detection in the nanomolecular range was achieved.
This method was applicable to the test compounds BuP-OH, HM-1, HM-1-oxime as
well as to the nucleotide analogs zalcitabine, capecitabine, 5-FU and
acyclovir. Aiming the detection of OxBu and OxHex likewise, an HPLC method
usinig adefovir as internal standard was established. This method seems to be
applicable for future detection of the potential phosphorylated metabolites of
OxBu and OxHex.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Polymerase alpha
dc.subject
Nukleosid-Analoga
dc.subject
Nukleotid-Analoga
dc.subject
Plattenepithelkarzinomen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::615 Pharmakologie, Therapeutik
dc.title
In-vitro-Testung und Analytik innovativer DNA Polymerase-α-Hemmer, entwickelt
für die topische Behandlung von Plattenepithelkarzinomen und Basaliomen
dc.contributor.contact
aschwank@zedat.fu-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Frau Professor Dr. Monika Schäfer-Korting
dc.contributor.furtherReferee
Herr Professor Dr. Burkhard Kleuser
dc.date.accepted
2009-09-11
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000013331-4
dc.title.translated
In-vitro-testing and analysis of innovative DNA Polymerase-α-Inhibitors
developed for topical treatment of squamous cell carcinomas and basalioms
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000013331
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006374
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access