Korrelation des Kontusionsvolumens (gemessen mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid) und der Immunzellinfiltration im Zeitverlauf nach experimenteller kortikaler Kontusion

Abstract

Einleitung: Das Ausmaß des Läsionsvolumens nach tierexperimentellem Hirntrauma ist ein wichtiger Parameter zur Beurteilung neuroprotektiver Strategien. Es existieren immer noch Unstimmigkeiten, ob das Kontusionsvolumen an Zeitpunkten über 72 Stunden nach dem Trauma dem Einfluss immunkompetenter Zellen unterliegt, wenn Energie-abhängige Enzymaktivitätsmethoden (2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid, TTC) zu Bestimmungen herangezogen werden. In diesem Kontext haben wir in einer Vergleichsstudie die Messergebnisse der Entwicklung der traumatischen Hirnläsion durch die Methoden Nissl und TTC miteinander verglichen und diese ergänzend mit der Immunhistochemie (IHC) korreliert. Material und Methoden: Prospektive, randomisierte tierexperimentelle Studie. 36 männliche Sprague Dawley Ratten wurden, entsprechend folgender Untersuchungszeitpunkten, in vier Gruppen unterteilt: 48, 72 Stunden, 5 und 7 Tage nach experimenteller traumatischer Läsion mittels Controlled Cortical Impact (CCI). Die chirurgischen Eingriffe wurden unter Isoflurananästhesie durchgeführt, wobei am CCI-Traumamodell eine fokale Läsion mit einer Penetrationstiefe von 1,5mm auf die intakte Dura mater des linken parieto-temporalen Kortex gesetzt wurde. An jedem der oben genannten Zeitpunkte verglichen wir die Kontusionsvolumina, die mit TTC- und der Nissl Methode gefärbt sowie planimetrisch gemessen wurden und setzten diese in Korrelation zur Immunhistochemie mittels des CD68+ sensitiven (Monozyten und aktivierte Microglia) Antikörpers ED-1. Für TTC wurden 1 - 2 mm dicke Gewebsschnitte angefertigt und mit 2%TTC in 0,2M Phosphatpuffer (pH 7,4) zur Bestimmung des Läsionsvolumens behandelt. Für Kontusionsvolumenmessungen mittels der Nissl (Cresyl Violet)-Methode wurden 30μm dicke Kryo- und für die IHC 8μm dicke Paraffinschnitte angefertigt. Ergebnisse: Mit TTC konnten maximale Kontusionsvolumina am 2. Tag (47,81±16,61mm3) nach CCI gemessen werden, gefolgt von kontinuierlich abnehmenden Werten am 3. (46,2±21,48mm3), 5. (24,53±5,81mm3) und schließlich dem 7. (20,68±12,10mm3) Tag nach dem Trauma. Während mit der Nissl-Methode vergleichbare Werte am 2. (42,77±10,59mm3) und 3. (43,12±3,55mm3) Tag nach dem Trauma erzielt wurden, wichen die Ergebnisse des 5. (48,46±5,2mm3) und 7. (48,43±9,43mm3) Tages nach dem Trauma signifikant (p<0.05) von den TTC-Werten an diesen Zeitpunkten ab. In der IHC zeichnete sich am 3. Tag (61,26±18,32cells/mm2) eine signifikante Zunahme ED-1 positiver Zellen mit weiterem Anstieg bis hin zum 5. Tag (910,53±129,1 cells/mm2), um 4 schließlich eine maximale Zelldichte am 7. Tag (1073±449,6 cells/mm2) nach dem Trauma zu erreichen. Schlussfolgerung: Die signifikanten Unterschiede der Messergebnisse der Kontusionsvolumina mit den Methoden nach Nissl und TTC am 5. und 7. Tag nach CCI sowie die in diesen Zeitpunkten dazu parallel stattfindende massive Infiltration von Immunzellen, suggerieren einen deutlichen Einfluss des enzymatischen Metabolismus von Immunzellen auf die TTC-Messmethode. Diesbezüglich sind die Untersuchungen der Entwicklung des Kontusionsvolumens durch die TTC-Methode nur bis zum 3. Tag nach einem Schädel-Hirn- Trauma zuverlässig. An späteren Zeitpunkten wird die Verwendung histologischer Methoden empfohlen.

Background: Quantification of lesion volume after experimental brain trauma is a key factor to evaluate potentially neuroprotective strategies. However, it remains controversial which histological staining method best describes real lesion volume over time in evolving contusional injury. Local infiltration of immune cells into pericontusional areas may alter energy-dependent enzyme activity such as triphenyltetrazolium-chloride (TTC). To test this hypothesis, contusion volume was quantified until 7 days after trauma using TTC, Nissl staining and immunhistochemistry (IHC) in a rat model of Controlled Cortical Impact Injury (CCI). Material and Methods: A left parietal focal cortical contusion was induced in 36 male isoflurane-anesthesized Sprague Dawley rats using the CCI model. Animals were then randomized to brain removal after 2, 3, 5 and 7 days. Contusion volume was quantified using TTC, Nissl and the CD68+ sensitive antibody ED-1. Results: TTC staining revealed maximum lesion volume 2 days after trauma (47,81±16,61 mm3) that declined steadily (day 3: 46,2±21,48 mm3, day 5: 24,53±5,81 mm3, day 7: 20,68±12,10 mm3). Nissl staining showed comparable lesion volume on day 2 (42,77±10,59 mm3) and day 3 (43,12±3,55 mm3), but contusional area was significantly elevated compared to TTC on day 5 (48,46±5,2 mm3, p<0.05) and day 7 (48,43±9,43 mm3, p<0.05). IHC showed an increasing number of ED-1+ cells until day 7 in the (peri)contusinal area (day 3: 61,26±18,32 cells/ mm2; day 5: 910,53±129,1 cells/ mm2; day 7: 1073±449,6 cells/ mm2. Conclusion: Differing contusion volumes and increasing immune cell infiltration in (peri)contusional areas suggest an alteration of enzymatic metabolism and TTC staining later than 3 days after trauma. TTC reliably demarcates contusion volume until 3 days after trauma, at later time points other histological methods should be used additionally.