Microvillus positioning of L-selectin and CD44 and its impact on leukocyte adhesion

Abstract

During inflammation and immune surveillance, initial contacts (tethering) between free-flowing leukocytes and the endothelium are vitally dependent on the presentation of the adhesion receptor L-selectin on leukocyte microvilli. Determinants that regulate receptor targeting to microvilli are, however, largely elusive. Therefore, we systematically swapped the extracellular (EC), transmembrane (TM) and intracellular (IC) domains of L-selectin and CD44, a hyaluronan receptor expressed on the cell body and excluded from microvilli. Electron microscopy of transfected human myeloid K562 cells showed that the highly conserved TM domains are responsible for surface positioning. The TM segment of L-selectin forced chimeric molecules to microvilli and the CD44 TM domain evoked expression on the cell body, while the IC and EC domains hardly influenced surface localization. Transfectants with microvillus-based chimeras showed a significantly higher adhesion rate to a physiological ligand under flow but not under static conditions as compared to cells with cell body- expressed receptors. Substitution of the IC domain of L-selectin by that of CD44 caused diminished tethering, but no change in surface distribution indicating that both microvillus positioning and cytoskeletal anchoring contribute to leukocyte tethering. These findings demonstrate that TM domains of L-selectin and CD44 play a crucial role in cell adhesion under flow by targeting receptors to microvilli or the cell body, respectively.

Das angeborene und erworbene Immunsystem umfasst verschiedene Zelltypen, die zur Ausübung ihrer Funktion die Blutbahn in Richtung Gewebe verlassen müssen. Zur Kommunikation der Zellen mit dem Gefäßendothel dienen Oberflächenrezeptoren, deren sequentieller Einsatz zur Extravasation führt. In Lymphozyten ist der initiale Schritt abhängig von L-Selektin (CD62L). Es ist bekannt, dass lymphozytäres L-Selektin fast ausschliesslich auf membranären Protrusionen, den Mikrovilli, exprimiert ist während der planare Zellkörper weitgehend ausgespart bleibt. Auch eine Vielzahl anderer Membranproteine werden aktiv in diesen Mikrodomänen gruppiert. Da diese besondere Oberflächentopologie eine funktionelle Bedeutung für die zelluläre Adhäsionsrate hat, ist die Entschlüsselung der biochemischen Mechanismen, die an der Kompartmentalisierung von Rezeptoren auf der Zelloberfläche beteiligt sind, von hoher Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß der extrazellulären (EC), transmembranären (TM) und intrazellulären (IC) Domäne von CD44, einem Protein mit Lokalisierung ausschliesslich auf dem planaren Zellkörper, und L-Selektin auf die Zelloberflächentopologie beider Proteine untersucht. Für diese Untersuchungen wurden chimäre Formen beider Adhäsionsrezeptoren konstruiert, in denen eine oder mehrere Domänen gezielt ausgetauscht wurden. Die chimären Proteine wurden in einem Modellsystem mit humanen K562 Zellen exprimiert und die Rezeptortopologie mittels Elektronenmikroskopie qualitativ und quantitiv ausgewertet. Mittels Flusskammerexperimenten konnte anschliessend die funktionelle Bedeutung der Oberflächenlokalisation beider Adhäsionsproteine eruiert werden. Es zeigte sich, daß die TM Domäne alleine die Lokalisation des Rezeptors auf der Zelloberfläche bestimmt. Der TM Abschnitt von CD44 führte unabhängig von der IC und EC Komponente zur Expression auf dem Zellkörper mit Aussparung der Mikrovilli. Entsprechend bewirkte der TM Abschnitt von L-Selektin eine ausschliesslich mikrovilläre Lokalisation. Die IC Verankerung von L-Selektin oder CD44 hatte keinen spezifischen Einfluß. Funktionell zeigten mikrovillär exprimierte Rezeptoren eine höhere Adhäsionsrate unter Fluss, aber nicht unter statischen Bedingungen. Wurde in CD44 die TM Domöne durch die von L-Selektin ersetzt, führte dies zu einer deutlichen Steigerung der Adhäsionsfähigkeit der transfizierten Zellen auf Hyaluronsäure unter Fluss-bedingungen. Austausch der IC Domäne von L-Selektin durch die von CD44 führte zu geringerer Adhäsion trotz gleichbleibender Membranpositionierung, was die Bedeutung der Verankerung von L-Selektin an das Zytoskelett für seine Funktionalität unterstreicht. Insgesamt zeigt diese Arbeit einen neuen Mechanismus der Kompart-mentalisierung von Oberflächenrezeptoren in unpolarisierten Zellen, der alleine durch transmembranäre Signale gesteuert wird und relevante Auswirkungen auf die zelluläre Adhäsion von Zellen des Immunsystems hat.